免疫调节和RNA干扰对乙型肝炎病毒特异性CD8T细胞识别HepG2-NTCP感染细胞的影响

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Immunomodulation and RNA interference alter hepatitis B virus–specific CD8 T-cell recognition of infected HepG2-NTCP

中文标题：免疫调节和RNA干扰改变感染HepG2-NTCP的HBV特异性CD8 T细胞的识别

发表期刊：《Hepatology》

影响因子：12.9

作者单位：

1. Department of Immunology, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada

2. Toronto Center for Liver Disease, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, Toronto, Ontario, Canada

作者信息：

Adrian Kuipery, Juan Diego Sanchez Vasquez, Aman Mehrotra, Jordan J. Feld, Harry L. A. Janssen, Adam J. Gehring

研究背景

CD8 T细胞在控制HBV(乙型肝炎病毒)感染中扮演着至关重要的角色，它们可以直接杀伤感染的肝细胞或通过产生IFN-γ来清除病毒。目前正在开发免疫调节剂和针对HBV的RNA干扰(RNAi)治疗，如慢性乙型肝炎(CHB)的治疗，这些治疗可能在除了它们的主要作用机制外，还会改变HBV抗原的呈递并影响CD8 T细胞的识别。核苷(酸)类似物(NUCs)能够抑制HBV的复制和肝炎症，但它们不能消除cccDNA和病毒抗原，也不能恢复抗病毒免疫，因此需要长期使用以防止疾病进展和病毒复发。新的治疗方法，如TLR7/8激动剂和siRNA，旨在抑制HBV复制和/或抗原产生，或诱导具有直接抗病毒活性的细胞因子。了解抗原减少如何影响肝细胞上T细胞的识别对于T细胞刺激方法至关重要，这也可能指导siRNA等抗原减少剂的停药时机。TLR激动剂可以驱动肝内的免疫反应，并可能增强HBV特异性CD8 T细胞对感染肝细胞的识别。因此，了解siRNA和免疫调节剂如何改变HBV特异性CD8 T细胞对感染肝细胞的识别对于未来HBV治疗策略的制定具有重要意义。

研究方法

在本研究中，作者采用了一系列的实验方法来探究HBV特异性CD8 T细胞的生产、HBV对HepG2-NTCP细胞的感染、替诺福韦酯(TDF)的处理效果、以及在条件培养基(CM)中细胞因子的定量。作者通过离心和DNA提取来定量细胞培养上清中的HBV松弛环状DNA，并利用免疫荧光测定来评估HBcAg的表达。此外，作者将HBV特异性CD8 T细胞与HepG2-NTCP细胞进行共培养，以研究T细胞对HBV感染细胞的识别能力。作者还生成了CM并对HepG2-NTCP细胞进行了TLR激动剂的处理，以及使用siRNA技术对免疫蛋白酶体和HBV特异性基因进行敲低。最后，作者通过统计分析软件对数据进行了分析，以评估实验结果的统计学意义。这些方法为作者提供了一个全面的实验框架，以便深入理解HBV感染机制和免疫反应。

实验结果

图1：“HepG2-NTCP体外感染模型：HBV感染特性、抗原表达及CD8 T细胞识别研究”

(A)HepG2-NTCP细胞被HBV感染，通过qPCR监测细胞培养上清中HBV的滴度，并以基因组当量(GE)每毫升的形式绘制图表。

(B)用1000 MOI(感染复数)感染HepG2-NTCP细胞的HBcAg(乙型肝炎核心抗原)表达。HBcAg染色(底部)，与DAPI(顶部;DAPI=蓝色，HBcAg=红色)叠加并伪彩色处理，100倍放大。

(C)在100 MOI感染下，HBV特异性CD8 T细胞对HepG2-NTCP感染(±)的识别。纵向监测HBcAg特异性(左侧)和HBsAg特异性(右侧)CD8 T细胞反应。

(D)感染的MOI增加与HBV特异性CD8 T细胞对感染HepG2-NTCP的识别增加相对应。

(C)和(D)的阳性对照为用1 µm的HBc18-27或HBs183-191脉冲处理的HepG2-NTCP细胞。实验结果代表了三次独立实验。**表示p < 0.01;****表示p < 0.001。

图2：“核苷(酸)类似物对HBV感染细胞CD8 T细胞识别的影响研究”

(A)HepG2-NTCP细胞被处理(±)与TDF(10 µm)长达9天。未处理的(顶部)和TDF处理的(底部)，100倍放大，叠加DAPI(蓝色)和HBcAg(红色)。

(B)TDF处理抑制HepG2-NTCP中的HBV复制。

(C)TDF处理并没有抑制HBcAg特异性CD8 T细胞对感染细胞的识别。每48小时补充一次TDF。*p < 0.05; ****p < 0.001。

图3：免疫调节化合物通过免疫激活间接改变CD8 T细胞识别

(A)通过细胞计数珠阵列(cytometric bead array)测量CM(培养基)中的细胞因子组成(N = 8个健康供体CM)。(B)直接通过TLR(Toll样受体)刺激HepG2-NTCP细胞不会改变CD8 T细胞对HBcAg(左侧)或HBsAg(右侧)的识别。实验结果代表了三次独立实验。(C)TLR刺激的CM增强了感染HepG2-NTCP中CD8 T细胞对HBcAg(左侧)和HBsAg(右侧)的识别(N = 5个健康供体CM)。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005。

图4：探究增强CD8 T细胞识别感染细胞的机制

(A)直接通过TLR(Toll样受体)刺激HepG2-NTCP细胞并未改变MHC-I(主要组织相容性复合体I)的呈递。(B)TLR刺激的培养基(CM)上调了HepG2-NTCP细胞上MHC-I的呈递。实验(A)和(B)代表了三次独立实验的结果。(C)在TLR和CM处理的HepG2-NTCP细胞中定量了组成型蛋白酶体和免疫蛋白酶体，与未刺激的CM相比，统计结果相对应。在TLR CM处理后，通过siRNA敲低PSMB8、-9和-10，抑制了HBsAg特异性CD8 T细胞的识别，但不影响HBcAg特异性CD8 T细胞的识别。(E)细胞因子阻断实验表明，TLR7 CM通过I型干扰素增强了HBsAg特异性CD8 T细胞的激活，而TLR8 CM则依赖于IFN-γ。*p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.001。Ab, 抗体;Cond. Media NS, 未刺激的培养基;siPSMB, PSMB的siRNA敲低。

图5：siHBV抑制CD8 T细胞对感染细胞的识别

(A)HepG2-NTCP细胞被转染了siHBV。使用200倍放大的显微镜观察并叠加DAPI(蓝色)和HBcAg(红色)，并随时间监测和定量HBcAg的表达。(B)使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达)对三个视野的图像进行分析。(C)用siHBV处理HepG2-NTCP细胞抑制了HBV复制和(D)HBsAg的产生。与用载体处理的感染细胞进行归一化比较。(E)siRNA处理HepG2-NTCP细胞抑制了HBcAg特异性CD8 T细胞对感染细胞的识别。与用载体处理的感染细胞进行归一化比较。(F)siHBV能够在TLR CM处理后抑制HBcAg和HBsAg特异性CD8 T细胞的识别。与肽脉冲阳性对照进行归一化比较。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005; ****p < 0.001。

研究结论

在实验中，HBV感染的HepG2-NTCP细胞经过不同的处理后，结果显示：使用替诺福韦酯(TDF)能够减少病毒复制，但对CD8 T细胞识别感染细胞没有影响;直接将TLR7/8激动剂作用于感染的HepG2-NTCP细胞并未改变T细胞的识别能力;而将感染的HepG2-NTCP细胞暴露于TLR7/8条件培养基(CM)中，则通过I型干扰素(IFN)和IFN-γ依赖的机制增强了HBV特异性CD8 T细胞的识别;RNAi技术迅速抑制了HBV-DNA、HBcAg和HBsAg的表达，从而影响了HBV特异性CD8 T细胞的识别。这些发现表明，免疫调节和RNAi能够改变HBV特异性CD8 T细胞对感染HepG2-NTCP细胞的识别，而核苷(酸)类似物则不能。这些认识对于制定慢性乙型肝炎的联合治疗策略具有重要意义。