低剂量二甲双胍通过PEN2靶向溶酶体AMPK通路

基本信息

英文标题：Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2

中文标题：低剂量二甲双胍通过PEN2靶向溶酶体AMPK通路

发表期刊：《Nature》

影响因子：64.8

作者单位：厦门大学

作者信息：林圣彩院士团队、邓贤明团队

研究背景

二甲双胍是治疗2型糖尿病的常用药物，具有抗衰老和抗癌的潜力。虽然AMPK在二甲双胍的作用机制中起重要作用，但其直接分子靶点尚未明确。

探讨二甲双胍在临床相关浓度下如何激活AMPK，以及其对细胞内AMP水平的影响。

研究者使用了多种细胞模型和生化分析方法，包括Western blot、酶活测定、细胞代谢分析等，以研究二甲双胍对溶酶体v-ATPase的抑制作用及其对AMPK激活的影响。

研究发现，二甲双胍在临床相关浓度下通过抑制溶酶体质子泵v-ATPase来激活AMPK，而不影响细胞内的AMP水平。这表明二甲双胍的作用机制可能涉及溶酶体功能的调节。

本研究揭示了二甲双胍通过抑制溶酶体质子泵v-ATPase来激活AMPK的新机制，为理解二甲双胍的生物学效应提供了新的视角，并为开发新的治疗策略提供了潜在的靶点。

研究方法

微阵列基因表达谱 从GEO数据库中检索到与心肌I/R损伤相关的mRNA数据集GSE4105和miRNA数据集GSE50885。构建了小鼠心肌I/R损伤模型，并对心肌组织进行了circRNA测序。

小鼠心肌I/R损伤模型的建立 使用了104只雄性C57BL/6小鼠，其中88只用于构建心肌I/R损伤模型，76只建模成功，其余16只进行了假手术。

心肌组织circRNA测序 建立了两个小鼠心肌I/R损伤模型用于测序，并使用两个正常心脏样本作为对照。

心脏功能指数测定 建模后7天，通过超声检测小鼠的心脏功能指数。

Evans Blue/TTC双重染色 通过Evans Blue/TTC双重染色来确定心肌缺血和梗死的面积。

HE染色 对石蜡包埋的心肌组织进行HE染色，以观察组织结构。

透射电镜(TEM) 使用透射电镜观察小鼠心肌组织的超微结构。

H/R细胞模型的开发和细胞处理 从1-2天大的C57BL/6小鼠中分离出心肌细胞，并在缺氧/复氧条件下处理。

免疫荧光检测 通过免疫荧光检测LC3荧光斑点的数量和分布。

Hoechst 33258染色 使用Hoechst 33258染色来观察细胞核形态。

双荧光素酶报告基因检测 通过双荧光素酶报告基因检测来验证circ_ZNF512和miR-181d-5p之间的结合。

细胞质/核分离试验 使用PARIS试剂盒分离细胞质和核成分。

RIP实验 使用RIP试剂盒来分析circ_ZNF512/miR-181d-5p和Ago2的结合。

RNA下拉实验 通过RNA下拉实验来检测circ_ZNF512的富集。

RNA分离和定量 从心肌组织和细胞中分离并定量总RNA。

Western Blot分析 通过Western Blot分析来检测蛋白表达。

实验结果

图1：二甲双胍通过不增加AMP/ADP水平激活AMPK。

a. 在小鼠原代肝细胞中，低剂量二甲双胍使溶酶体去酸化(左)。细胞用5μM二甲双胍(Met)处理2小时，Lysosensor的相对荧光强度如右图所示。

b. 二甲双胍不会增加小鼠原代肝细胞中的AMP/ADP水平。细胞用5μM二甲双胍处理指定时间后，通过免疫印迹(IB;左)分析磷酸化的(p)-AMPKα和p-ACC，通过质谱法(底部右)分析AMP/ATP和ADP/ATP比率，AMP、ADP和ATP的绝对浓度。用PBS洗涤三次后，通过质谱法(顶部右)测量细胞内二甲双胍浓度(conc.)。有关凝胶源数据，请参见补充图1。数据为均值 ± 标准误差，n值在每个面板上都有标记。P值使用双侧Mann–Whitney检验(a)或单因素方差分析(ANOVA)后进行Tukey检验(b，底部右)或Sidak检验(b，顶部右)计算。a中的实验进行了三次，b中的实验进行了五次。

要点：

低剂量二甲双胍能够使小鼠原代肝细胞中的溶酶体去酸化。

二甲双胍处理后，通过免疫印迹检测到磷酸化的AMPKα和p-ACC水平增加，表明AMPK被激活。

质谱分析显示，二甲双胍处理后，细胞内的AMP/ATP和ADP/ATP比率没有显著变化，AMP、ADP和ATP的绝对浓度也没有增加。

实验结果表明，二甲双胍通过不增加AMP/ADP水平来激活AMPK。

本研究中的实验重复次数分别为a部分三次，b部分五次，以确保数据的可靠性。

图2：PEN2与二甲双胍结合，并且是低剂量二甲双胍诱导的AMPK激活所必需的

a. 一个示意图，展示了使用光活性二甲双胍探针(Met-P)从纯化自MEFs的溶酶体蛋白提取物中识别二甲双胍靶点的亲和力为基础的方法。MS，质谱。

b, c. Pen2基因敲除阻断了低剂量二甲双胍激活的AMPK。小鼠原代肝细胞(b)和MEFs(c;克隆1，除非另有说明，否则后续均为此克隆)分别用5μM和200μM二甲双胍处理2小时和12小时，然后分析p-AMPKα和p-ACC。WT，野生型。

d, e. MEFs的STORM图像(d)和HEK293T细胞的TEM图像(e)显示PEN2的一部分定位于溶酶体(e，黑色箭头)，并与溶酶体标记物LAMP2(d)重叠。

f, g. PEN2能够与二甲双胍结合。f, 在SPR测定中，PEN2与指定浓度的二甲双胍孵育。g, 在Met-P1结合测定中，转染PEN2或PEN2-2A的HEK293T细胞被裂解，与10μM Met-P1孵育，然后生物素化，接着进行生物素化蛋白质的亲和力沉淀(AP)。

h. PEN2-2A不介导二甲双胍激活的AMPK。Pen2–/– MEFs重新引入了带有HA标签的PEN2-2A，用200μM二甲双胍处理12小时，然后分析p-AMPKα和p-ACC。有关凝胶源数据，请参见补充图1。本图中的实验进行了三次，除了b和c，它们进行了四次。

要点：

通过亲和力方法，使用光活性二甲双胍探针(Met-P)从MEFs的溶酶体蛋白提取物中鉴定出二甲双胍的靶点，并通过质谱进行确认。

在小鼠原代肝细胞和MEFs中，Pen2基因敲除后，低剂量二甲双胍无法激活AMPK，表明PEN2在二甲双胍激活AMPK中起关键作用。

STORM和TEM图像显示，PEN2在MEFs和HEK293T细胞中部分定位于溶酶体，并与溶酶体标记物LAMP2重叠。

SPR和Met-P1结合测定表明，PEN2能够与二甲双胍结合。

在Pen2–/– MEFs中重新引入PEN2-2A后，二甲双胍无法激活AMPK，说明PEN2-2A不介导二甲双胍的AMPK激活作用。

本图中的实验重复次数为三次，除了b和c部分进行了四次，以确保结果的可靠性。

图3：ATP6AP1将PEN2与v-ATPase连接起来以激活AMPK

a–c. 通过免疫共沉淀(IP)和免疫印迹(IB)确定ATP6AP1是PEN2的相互作用蛋白。a, 在表达HA–PEN2或Myc–ATP6AP1的HEK293T细胞裂解物中孵育10μM二甲双胍，然后进行PEN2和AP1蛋白的免疫共沉淀。b, c, 分别在野生型MEFs、Pen2–/– MEFs或Atp6ap1–/– MEFs的裂解物中孵育10μM二甲双胍，然后进行PEN2和AP1蛋白的免疫共沉淀。

d. 二甲双胍不促进ATP6AP1与PEN2-20A之间的相互作用。转染HA标签的PEN2或PEN2-20A的HEK293T细胞裂解物按照a中的方法处理，然后通过IP和IB分析ATP6AP1与PEN2的相互作用。

e–i. 失去PEN2–ATP6AP1相互作用会废除二甲双胍对AMPK激活的影响。e, 在Atp6ap1–/– MEFs中重新引入ATP6AP1Δ420–40，f, 在Pen2–/– MEFs中重新引入PEN2-20A突变体，然后用200μM二甲双胍处理12小时，随后分析p-AMPK和p-ACC。g–i, 分析了ATP6AP1和PEN2突变体对AXIN向溶酶体转运(g)以及AXIN为基础的复合物形成(h, i)的影响。Concanamycin A(conA;5μM，2小时)用作对照。FL，全长。

j. 一个示意图，展示了二甲双胍–PEN2–ATP6AP1和FBP–醛缩酶轴构成两条汇合到v-ATPase的输入分流，通过溶酶体途径引发AMPK激活。有关凝胶源数据，请参见补充图1。数据为均值 ± 标准误差，n值在每个面板上都有标记，P值使用双侧Student’s t检验(a，针对Myc–ATP6AP1)、双侧Student’s t检验带Welch’s校正(a，针对HA–PEN2)或双向ANOVA，随后进行Tukey’s检验(g)计算。本图中的实验进行了三次，除了a部分进行了四次，h和i部分进行了五次。

要点：

通过免疫共沉淀和免疫印迹技术，确定了ATP6AP1是PEN2的相互作用蛋白，并且这种相互作用在二甲双胍处理后增强。

二甲双胍不促进ATP6AP1与PEN2-20A之间的相互作用，表明PEN2的特定区域对于与ATP6AP1的结合是必要的。

在Atp6ap1–/– MEFs中重新引入ATP6AP1Δ420–440突变体，以及在Pen2–/– MEFs中重新引入PEN2-20A突变体后，二甲双胍无法激活AMPK，说明PEN2–ATP6AP1相互作用对于二甲双胍激活AMPK是必需的。

分析了ATP6AP1和PEN2突变体对AXIN向溶酶体转运以及AXIN为基础的复合物形成的影响，发现这些过程受到PEN2–ATP6AP1相互作用的影响。

提出了一个模型，说明二甲双胍通过与PEN2结合，进而与ATP6AP相互作用，最终通过溶酶体途径激活AMPK。

本图中的实验重复次数为三次，除了a部分进行了四次，h和i部分进行了五次，以确保结果的可靠性。

图4：PEN2和ATP6AP1是二甲双胍生物效应所必需的

a, b. 肠道PEN2对于二甲双胍诱导的血糖降低效应是必需的。PEN2-IKO小鼠按照扩展数据图12d所示给予二甲双胍。然后进行口服葡萄糖耐量测试分析(a)、测量十二指肠二甲双胍浓度(b，左)以及在葡萄糖灌胃前后的血浆GLP-1水平测量(b，右)。

c, d. PEN2对于二甲双胍诱导的肝脏脂肪减少是必需的。在肝脏中特异性敲除Pen2的小鼠按照扩展数据图12f所示给予二甲双胍。在二甲双胍治疗16周后，显示小鼠的腹腔内葡萄糖耐量测试结果(c)和肝脏TAG水平(d)。

e, f. ATP6AP1对于二甲双胍诱导的肝脏脂肪减少是必需的。小鼠按照扩展数据图12m所示给予二甲双胍。在二甲双胍治疗16周后，显示小鼠的腹腔内葡萄糖耐量测试结果(e)和肝脏TAG水平(f)。

g, h. PEN2和ATP6AP1是二甲双胍诱导的寿命延长所必需的。用siRNA敲低pen-2(T28D6.9)的WT(N2)线虫(g)或表达全长ATP6AP1或ATP6AP1Δ420–440的ATP6AP1–/–(vha-19)线虫(h)用50 mM二甲双胍处理。寿命数据以Kaplan–Meier曲线显示(统计分析见补充表3)。Ctrl，对照。

i, j. PEN2和ATP6AP1是饮食中0.1%二甲双胍诱导的AMPK激活所必需的。5周龄的PEN2-LKO小鼠(i;4周龄时注射他莫昔芬)或8周龄的表达ATP6AP1Δ420–440的ATP6AP1-LKO小鼠(j;4周龄时注射病毒，5周龄时注射他莫昔芬)按照之前描述的方法10给予含有0.1%二甲双胍的正常饲料1周。然后通过免疫印迹分析肝脏AMPK激活。有关凝胶源数据，请参见补充图1。数据以均值 ± 标准误差显示，n值在每个面板上都有标记，P值使用双向重复测量ANOVA，随后进行Tukey’s检验(a, c和e比较WT/ATP6AP1-FL + Met组和PEN2-IKO/LKO/ATP6AP1Δ420–440 + Met组在每个时间点的血糖水平;另见a, c和e的插图中的接收者操作特征曲线(AUC)值，以及使用双向ANOVA，随后进行Tukey’s检验的P值)，双侧Student’s t检验(b，左)，以及双向ANOVA，随后进行Tukey’s检验(b的右图板，以及d, f)。本图中的实验进行了三次。

要点：

肠道PEN2对于二甲双胍诱导的血糖降低效应是必需的，PEN2-IKO小鼠在给予二甲双胍后血糖降低效果减弱。

PEN2对于二甲双胍诱导的肝脏脂肪减少是必需的，肝脏特异性敲除Pen2的小鼠在给予二甲双胍后肝脏脂肪减少效果减弱。

ATP6AP1对于二甲双胍诱导的肝脏脂肪减少是必需的，ATP6AP1–/–小鼠在给予二甲双胍后肝脏脂肪减少效果减弱。

PEN2和ATP6AP1是二甲双胍诱导的寿命延长所必需的，敲低pen-2或ATP6AP1–/–的线虫在给予二甲双胍后寿命延长效果减弱。

PEN2和ATP6AP1是饮食中0.1%二甲双胍诱导的AMPK激活所必需的，PEN2-LKO和ATP6AP1-LKO小鼠在给予含有0.1%二甲双胍的饲料后肝脏AMPK激活效果减弱。

本图中的实验重复次数为三次，以确保结果的可靠性。

研究结论

PEN2是二甲双胍的靶点，通过与ATP6AP1结合抑制v-ATPase的活性，激活溶酶体AMPK，从而实现二甲双胍的有益效应。

PEN2-ATP6AP1轴与溶酶体v-Pase-AXIN-AMPK轴相交，使低浓度的二甲双胍能够利用AMP独立的AMPK激活途径，类似于葡萄糖饥饿或卡路里限制。

PEN2-ATP6AP1轴对于二甲双胍的三大有益效应——餐后血糖降低、肝脏脂肪减少和寿命延长——是必需的，这些效应严格依赖于AMPK。

二甲双胍通过促进肠道GLP-1的分泌以依赖AMPK的方式降低血糖，但低剂量的二甲双胍不抑制肝脏糖异生。

PEN2-ATP6AP1轴还参与二甲双胍抑制mTORC1信号传导，但mTORC1的抑制不涉及由AMPK介导的有益效应。

二甲双胍信号与溶酶体AMPK途径的交叉，而不干扰AMP/ADP水平，可能是二甲双胍具有许多益处而副作用较少的原因。

PEN2-ATP6AP1轴为筛选二甲双胍的替代品提供了潜在目标，这可能适用于更广泛的组织，如肌肉，从而在治疗糖尿病和其他代谢疾病方面产生更好的疗效。