Chemerin肽类似物促进两种人类结直肠癌异种移植模型中的肿瘤生长

Fluc细胞是经过基因工程改造后能够表达萤火虫荧光素酶的细胞，因其高灵敏度、低背景干扰、蛋白稳定性强和耐热性而在生物医学研究和药物开发中被广泛应用。这些细胞不仅能够用于验证miRNA与mRNA、lncRNA、circRNA之间的相互作用，还能动态监控肿瘤生长和转移，以及研究CAR-T细胞治疗的效果。Fluc细胞的高灵敏度和稳定性减少了对样本的侵入性，保持了细胞或组织的天然状态，而其快速反应和低背景发光特性，预示着在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。随着技术的发展，Fluc细胞的应用将进一步扩展，为疾病研究和治疗提供更多可能性。

基本信息

英文标题：A Chemerin Peptide Analog Stimulates Tumor Growth in Two Xenograft Mouse Models of Human Colorectal Carcinoma

中文标题：Chemerin肽类似物促进两种人类结直肠癌异种移植模型中的肿瘤生长

发表期刊：《Cancers》

影响因子：6.6

作者单位：

1. Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité—University Medicine Berlin, Corporate Member of Free University Berlin and Humboldt University Berlin, 13353 Berlin, Germany

2. Department of Nephrology, University Hospital Essen, University Duisburg-Essen, 45127 Essen, Germany

3. Partner Site Berlin, German Cancer Consortium (DKTK), 13353 Berlin, Germany

4. German Cancer Research Center (DKFZ), 69120 Heidelberg, Germany

作者信息：

Justa Friebus-Kardash, Petra Schulz, Sandy Reinicke, Cordula Karthaus, Quirino Schefer, Sebastian Bandholtz, Carsten Grötzinger

研究背景

Chemerin的血浆浓度已被报道与结直肠癌(CRC)的风险呈正相关。然而，Chemerin在CRC肿瘤发生和进展中的潜在调控作用尚未在实验环境中进行研究。本研究旨在通过体外实验和动物模型探讨Chemerin类似物CG34对CRC细胞系的增殖、集落形成和迁移的影响，以验证这一假设。研究结果表明，尽管CG34对三种CRC细胞系的单层增殖没有明显的刺激作用，但它促进了三维聚集体中的集落形成，并且对细胞迁移没有影响。在治疗研究中，CG34显著刺激了HCT116-luc和HT29-luc异种移植瘤的生长和生物发光信号。这些发现首次表明Chemerin信号在CRC中具有刺激肿瘤生长的效应。

研究方法

本研究采用了一系列实验方法来评估Chemerin类似物CG34对结直肠癌(CRC)细胞增殖、集落形成和迁移的影响。

实验包括

1) 使用RT-qPCR技术分析RNA表达；

2) 通过ELISA检测细胞培养上清中的Chemerin；

3) 利用DAPI染色和Bright-Field显微镜评估细胞增殖；

4) 通过集落形成实验检测细胞在三维条件下的生长；

5) 使用划痕实验评估细胞迁移；

6) 在HCT116-luc和HT29-luc异种移植小鼠模型中进行CG34治疗研究，监测肿瘤生长和生物发光信号；

7) 通过CD31和Ki67免疫组化染色分析肿瘤血管密度和增殖活性。这些方法综合评估了CG34对CRC细胞行为的影响，并在体内外模型中进行了验证。

实验结果

图1：人结直肠及其他癌细胞系中Chemerin信号通路相关基因mRNA表达水平的定量分析

通过定量RT-qPCR测定的人结直肠及其他癌细胞系中CMKLR1、GPR1、CCRL2和Chemerin(RARRES2)mRNA的表达。(A) CMKLR1;(B) GPR1;(C) CCRL2;(D) Chemerin(RARRES2)。上图部分表示肿瘤起源的器官;细胞系名称在底部提供。数据已标准化至参考基因UBC、ALG9和GAPDH。图中的1值对应于cq值为34。所有数据表示为2-5次独立实验的平均值±标准误差;n.d. = 未检测到mRNA。

图2："结直肠癌及其他癌细胞系分泌Chemerin肽的定量分析"

"结直肠癌及其他癌细胞系分泌Chemerin肽的量通过ELISA测定细胞培养上清液中的浓度。细胞在大约70%的密度下培养;在24小时孵育后收集上清液。上图部分表示肿瘤起源的器官;细胞系名称在底部提供。所有数据表示为2-6次独立实验的均值±标准差，每个实验均进行了双重测定"。

图3：CG34对结直肠癌细胞系增殖影响的体外实验分析

Chemerin肽类似物CG34对三种荧光素酶表达的结直肠癌细胞系(HCT116-luc、HT29-luc、SW620-luc)体外增殖的影响，通过与低血清培养基(阴性对照)和高血清培养基(阳性对照)的终点实验(IN Cell高含量分析DAPI染色细胞核，上图A-D)以及与对照组(仅培养基)的动态实验(使用Incucyte活细胞显微镜测量细胞汇合度，下图E-H)进行比较。图A展示了模式识别算法检测DAPI染色细胞核的示例图像(比例尺：50微米);定量结果分别为图B的HCT116-luc、图C的HT29-luc和图D的SW620-luc。图E展示了五天内活细胞显微镜实验的动态结果(黑色：对照细胞，红色：CG34处理细胞)。定量结果分别为图F的HCT116-luc、图G的HT29-luc和图H的SW620-luc。所有数据表示为3次(DAPI细胞核计数)或5次(动态显微镜独立实验)的均值±标准差。

图4：CG34对结直肠癌细胞系集落形成和迁移能力的影响

Chemerin肽类似物CG34与对照组(仅有培养基)对三种荧光素酶表达的结直肠癌细胞系(HCT116-luc、HT29-luc、SW620-luc)的集落形成和迁移的影响。(A) 集落形成实验结果。集落形成数据表示为3-4次独立实验的平均值±标准差，每个实验重复三次。统计显著性通过非配对t检验确定;* p < 0.05, ** p < 0.01。(B) 治疗开始时(0小时)迁移实验的示例图像。(C) 与(B)相同的孔在20小时后拍摄的图像。(D-F) 迁移实验的定量结果：(D) HCT116-luc;(E) HT29-luc;(F) SW620-luc。迁移数据表示为4次独立实验的平均值±标准差，每个实验重复九次。

图5：CG34对人类结直肠癌异种移植小鼠模型生长的影响

展示了Chemerin肽类似物CG34对两种人类结直肠癌异种移植小鼠模型(HCT116-luc和HT29-luc)生长的影响。研究中，将表达荧光素酶的HCT116-luc和HT29-luc细胞接种到雌性NMRI裸鼠体内，从接种后第8天开始，对小鼠进行为期21天的CG34或水的腹腔注射治疗。实验期间，每周监测肿瘤体积和生物发光信号，最终在第28天结束治疗后，通过卡尺测量和生物发光成像仪记录数据。实验结束后，对牺牲的小鼠进行肿瘤体积和重量的测量，以评估CG34对肿瘤生长的影响。所有数据均为每组6个肿瘤的平均值±标准误差或标准差，并通过非配对t检验或Mann-Whitney检验进行统计验证，以确定CG34治疗的显著性。

图6：异种移植肿瘤治疗后血管密度和增殖活性的免疫组化分析

图展示了在完成图5所示的治疗研究后，对异种移植肿瘤组织切片进行的免疫组化分析和定量研究，以评估血管密度(通过CD31染色)和肿瘤细胞的增殖活性(通过Ki67染色)。这些定量数据基于15-24个显微镜视野的分析，结果显示了平均值±标准差。为了确定治疗组与对照组之间的差异是否具有统计学意义，采用了非配对t检验，其中*表示p值小于0.05，表示差异显著。图像中的比例尺为50微米，以供参考。

研究结论

研究结论表明，Chemerin信号通路在结直肠癌(CRC)细胞系中具有不同的表达水平，且Chemerin类似物CG34在体外能显著促进CRC细胞系的集落形成，而在体内动物模型中，CG34处理的肿瘤体积和生物发光强度高于对照组，表明CG34可能促进了肿瘤生长和细胞增殖。