CRISPR技术联合单细胞RNA测序在乙肝感染研究中的应用

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：CRISPR Technique Incorporated with Single-Cell RNA Sequencing for Studying Hepatitis B Infection

中文标题：利用CRISPR技术与单细胞RNA测序研究乙型肝炎感染

发表期刊：《Analytical Chemistry》

影响因子：6.7

作者单位：

1.Li Ka Shing Institute of Virology, Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada T6G 2E1

2.Division of Analytical and Environmental Toxicology, Department of Laboratory Medicine and Pathology, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada T6G 2G3

3.High Content Analysis Core Facility, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada T6G 2R3

作者信息：

Connie Le, Yanming Liu, Joaquín López-Orozco, Michael A. Joyce, X. Chris Le, D. Lorne Tyrrell

研究背景

单细胞RNA测序(scRNA-seq)在研究分子事件和细胞异质性方面表现出色，尤其在SARS-CoV-2感染研究中，揭示了病毒引起的免疫细胞变化和感染动力学。然而，其在富集低丰度基因方面存在挑战。本研究旨在开发一种利用CRISPR技术的选择性富集技术，以改善这一问题。该技术通过切割大量宿主转录本，选择性扩增低丰度序列，便于后续高通量测序。研究聚焦于感染HBV的肝细胞，HBV是全球肝病死亡的主要原因之一，其感染机制尚未完全阐明。本研究利用CRISPR-Cas9技术耗竭高丰度基因，优先富集HBV转录本，以期为HBV感染研究提供新方法。

研究方法

本研究中，先用含4%成人血清的DMEM培养基培养Huh7.5-NTCP细胞并感染HBV。接着，从处理后的细胞单层制备单细胞悬液，按10X Genomics协议进行单细胞RNA测序文库制备，转录本长度120至420核苷酸。之后，用Illumina HiSeq PE150平台测序，平均深度约25000读长/细胞，采用成对端和单索引参数。数据分析用Seurat V3软件包进行。同时，通过PCR技术富集HBV读数，线性扩增HBV转录物最后120个核苷酸后进行指数扩增和重叠PCR。此外，用CRISPR-Cas9技术耗竭高丰度基因，设计sgRNA靶向三个最丰富基因，处理样品但不破坏HBV转录本。最后，提取纯化完整HBV序列并进行重叠PCR。

实验结果

图1：Huh7.5-NTCP细胞单细胞RNA测序分析：HBV感染影响

对未进行基因组富集的Huh7.5-NTCP细胞开展单细胞RNA测序分析，这些细胞分为模拟感染(作为对照组)和HBV感染两组。

(A)图中每个点对应一个细胞，其中红色点标识出能检测到HBV RNA的细胞。(B)展示的是单个细胞内HBV RNA的相对表达水平，该水平是经自然对数Ln尺度归一化处理的。此处的UMAP是“均匀流形近似和投影”的缩写。

图2：PCR基因组富集后Huh7.5-NTCP细胞的单细胞RNA测序分析

对采用PCR进行基因组富集后的Huh7.5-NTCP细胞进行单细胞RNA测序分析，这些细胞分为模拟感染(对照组)和HBV感染组。

(A)图中每个点代表一个细胞，红色点表示可检测到HBV RNA的细胞。(B)展示的是单个细胞中HBV RNA的相对表达水平，该水平是经自然对数Ln尺度在单细胞间进行归一化处理的。

图3：PCR扩增与CRISPR技术基因组富集后Huh7.5-NTCP细胞的单细胞RNA测序分析

对经PCR扩增和CRISPR技术进行基因组富集的Huh7.5-NTCP细胞开展单细胞RNA测序分析，细胞分为模拟感染(对照)和HBV感染两组。(A)图中每个点代表一个细胞，红色点标识出能检测到HBV RNA的细胞。(B)展示单个细胞内HBV RNA的相对表达水平，该水平经自然对数Ln尺度在单细胞间归一化处理。右侧的“小提琴”图描绘了细胞中HBV RNA表达水平的分布情况。

图4：Huh7.5-NTCP细胞在四种不同处理条件下单细胞RNA测序数据的聚类分析

对Huh7.5-NTCP细胞在四种不同处理条件下的单细胞RNA测序数据进行聚类分析，这四种条件分别为：模拟感染、HBV感染、模拟感染加干扰素(IFN)处理、HBV感染加干扰素(IFN)处理。分析涵盖了7370个细胞。结果显示，基于基因表达，这些细胞被划分为九个不同的聚类群。

研究结论

研究发现，直接单细胞RNA测序分析显示仅0.6%的HBV感染Huh7.5-NTCP细胞能检测到HBV基因。通过PCR扩增后，约7%的细胞可检测到HBV基因，但同时富集了其他高丰度基因。利用CRISPR技术耗竭高丰度基因后，74%的HBV感染细胞能检测到HBV基因表达。基因聚类分析显示，HBV感染未显著改变宿主细胞基因表达，而干扰素处理则显著改变了基因表达，表明HBV是一种“隐身病毒”，既不刺激也不抑制干扰素反应。CRISPR技术在富集HBV转录本中发挥了关键作用，支持了HBV作为“隐身病毒”的结论。