一种用于深部肿瘤生物成像的载体纳米平台

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：A Vector Nanoplatform for the Bioimaging of Deep-Seated Tumors

中文标题：一种用于深部肿瘤生物成像的载体纳米平台

发表期刊：《Acta Naturae》

影响因子：2

作者单位：

1.Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, Russian Academy of Science, Moscow, 117997 Russian Federation

2.Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, 119991 Russian Federation

3.National Research Centre “Kurchatov Institute”, Moscow, 123098 Russian Federation

作者信息：E. I. Shramova, S. M. Deyev, G. M. Proshkina

研究背景

尽管癌症治疗取得了巨大进展，但由于早期诊断和创新疗法的不足，癌症仍然是全球死亡的主要原因之一。肿瘤的转移扩散是癌症患者死亡的主要原因，因此开发新的模型系统和用于临床前研究的创新技术非常重要，这些技术和模型系统可以评估肿瘤进展过程和对治疗的反应。目前对肿瘤发生的分子基础的了解推动了针对特定癌症类型或亚型的特定分子靶点的靶向疗法的开发，这些靶点包括细胞表面抗原、生长因子、受体或调节细胞周期、增殖、转移扩散和血管生成的信号传导途径。随着肿瘤分子分型技术的进步，临床前肿瘤和转移的无创靶向分子成像技术正在实验肿瘤学中得到快速发展。实时全身体光生物成像基于荧光和发光系统，是现代临床前研究的不可或缺的工具。生物发光成像依赖于通过荧光素酶氧化特定底物产生的可见光的检测，而荧光成像则需要外部光源来激发荧光标记，这限制了该方法在检测深部肿瘤中的应用。为了克服这些限制，正在开发基于共振能量转移机制的光学生物成像方法，如生物发光共振能量转移(BRET)或荧光共振能量转移(FRET)，这些方法在临床前研究中越来越被采用。BRET系统在全身水平的检测灵敏度更高，因此更受欢迎，因为它们缺乏与荧光团激发相关的自荧光和光漂白。

研究方法

本研究通过基因克隆和蛋白质生产，将NanoLuc-LSSmKate1基因克隆到pET22b载体中，并通过自动诱导方法生产NanoLuc-LSSmKate1、NanoLuc和DARPin_9-29蛋白。通过记录NanoLuc-LSSmKate1和NanoLuc在furimazine存在下的发光光谱，评估了BRET效率。接着，将NanoLuc-LSSmKate1包载到脂质体中，并通过sulfo-EMCS和DARPin 9-29的功能化，制备了HER2特异性脂质体。使用SKOV3ip1和SKOV3.ip1-NanoLuc细胞系进行实验，通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估了DARPin 9-29靶向模块的功能活性和结合能力。最后，通过在Balb/c nu/nu小鼠中进行生物发光成像，评估了脂质体在体内的效果。

实验结果

图1：基于NanoLuc-LSSmKate1 BRET传感器和HER2特异性脂质体的靶向纳米平台用于深部肿瘤的无创诊断

将基因编码的NanoLuc-LSSmKate1 BRET传感器整合到脂质体中，脂质体的外表面修饰有HER2特异性DARPin 9-29模块。在动物体内存在荧光素酶底物的情况下，红荧光蛋白无需外部光源即可被激活，从而实现在动物体内对深部肿瘤的活体实时检测。

图2：NanoLuc-LSSmKate1 BRET传感器的特性

(A) NanoLuc荧光素酶在30 μM furimazine存在下的归一化发光光谱(蓝色曲线)和LSSmKate1荧光(深红色曲线)。

(B) NanoLuc-LSSmKate1 BRET传感器的示意图及工作原理：NanoLuc荧光素酶高度特异性地氧化其底物furimazine，其氧化形式furimamide在蓝光谱区发光。部分能量非辐射性地转移到与NanoLuc荧光素酶位于同一多肽链上的LSSmKate1，使LSSmKate1开始荧光。

(C) 纯化NanoLuc-LSSmKate1蛋白的吸收光谱和体外蛋白样品。

(D) 在荧光素酶底物存在下，使用IVIS Spectrum CT系统在无外部光激发(激发阻断模式)条件下记录的NanoLuc-LSSmKate1(薰衣草色曲线)和NanoLuc(蓝色曲线)的荧光光谱。提供了计算NanoLuc-LSSmKate1系统中共振能量转移效率的公式。

图3：载有NanoLuc-LSSmKate1 BRET传感器的HER2特异性脂质体的特性

(A) 空脂质体(绿色曲线)和含NanoLuc-LSSmKate1的脂质体(蓝色曲线)的吸收光谱。紫色曲线对应于包载入脂质体中的NanoLuc-LSSmKate1蛋白。

(B) 流式细胞术数据显示DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1)与HER2阳性SKOV3.ip1细胞的受体特异性相互作用。蓝色曲线对应于细胞的自荧光(对照)，绿色曲线对应于经DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1)处理的细胞。图中显示了平均荧光强度(MFI)。信号在488 nm激光激发下在红色荧光通道(PerCp-H，615±20 nm)检测。

(C) SKOV3.ip1细胞与DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1)孵育20分钟(左图)和90分钟(右图)后的合并共聚焦图像。蓝色荧光通道(λ= 405 nm，检测410-520 nm)和红色荧光通道(λ= 488 nm，检测600-755 nm)的图像合并显示。细胞核用Hoechst 33342染色。

图4：载有NanoLuc-LSSmKate1 BRET传感器的HER2特异性脂质体在光学生物成像中的应用

实时活体发光(上)和荧光(下)图像在IVIS Spectrum CT系统上记录。图像在两种不同的信号检测模式下获得：上图在生物发光模式下;下图在无荧光团激发的荧光模式下。

研究结论

本研究开发了一种系统，能够实时无创检测HER2阳性的腹膜播散性肿瘤，利用载有NanoLuc-LSSmKate1 BRET传感器的靶向脂质体。该系统具有高BRET传感器包载效率(图3)和体外及体内对HER2受体的特异性(图3和图4)，能够进行全身无创肿瘤过程成像(图4)。我们认为，基于NanoLuc-LSSmKate1 BRET传感器的实时光学生物成像靶向系统，可以成为优化新型靶向药物临床前研究的高效平台。此外，通过简单改变脂质体表面的载体分子，开发的靶向BRET传感器原理可以成为非侵入性成像任何分子特征深部肿瘤的通用平台。