MicroRNA 130a通过关键代谢途径调控丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒复制

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：MicroRNA 130a Regulates both Hepatitis C Virus and Hepatitis B Virus Replication through a Central Metabolic Pathway

中文标题：MicroRNA 130a通过关键代谢途径调控丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒复制

发表期刊：《Journal of Virology》

影响因子：5.4

作者单位：

1.Institute of Blood Transfusion, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Chengdu, China

2.Liver Center, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA

3.Gastrointestinal Division, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.

作者信息：

Xiaoqiong Duan, Shilin Li, Jacinta A. Holmes, Zeng Tu, Yujia Li

研究背景

丙型肝炎病毒(HCV)感染已被证明可以在患者活检样本和培养细胞中调节微小RNA 130a(miR-130a)。本研究旨在鉴定miR-130a的靶基因，并探索其调控HCV和乙型肝炎病毒(HBV)复制的机制。通过生物信息学软件(包括miRanda、TargetScan、PITA和RNAhybrid)预测潜在的miR-130a靶基因，并利用小干扰RNA(siRNA)或CRISPR/Cas9引导RNA(gRNA)对miR-130a及其靶基因进行过表达或敲低。通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和西方印迹法分别测量了选定基因的mRNA及其蛋白，以及HCV和HBV在不同细胞系中的复制情况。研究结果表明，miR-130a通过靶向丙酮酸激酶(PKLR)并影响丙酮酸的产生来调控HCV和HBV的复制。

研究方法

本研究采用多种实验方法探讨了miR-130a对HCV和HBV复制的调控机制。使用人肝癌细胞系Huh7.5.1和HepAD38进行细胞培养和病毒感染实验，通过Lipofectamine LTX转染miR-130a模拟物、抑制剂、siRNA和CRISPR/Cas9 gRNA，验证miR-130a的靶基因。利用双荧光素酶报告基因检测验证PKLR等靶基因，通过qRT-PCR和Western blotting检测基因表达和蛋白水平。此外，通过丙酮酸处理实验和HBV DNA提取(使用Qiagen DNA minikit)进一步研究代谢途径对病毒复制的影响。

实验结果

图1：miR-130a通过靶向PKLR 3'UTR抑制基因表达

实验将Huh7.5.1细胞与包含PKLR-3'UTR-WT、PKLR-3'UTR-Mut、IL18BP-3'UTR-WT或LDLR-3'UTR-WT的pEZX-MT06质粒共转染，并加入miR-130a模拟物或阴性对照。结果显示，miR-130a模拟物显著降低了PKLR-3'UTR-WT的hLuc/Rluc比值，表明其抑制了荧光素酶表达;而当PKLR-3'UTR的miR-130a结合位点被删除后，这种抑制作用消失。此外，miR-130a对IL18BP和LDLR的3'UTR无显著影响。实验重复三次，结果具有统计学意义(P<0.001)。研究证实了miR-130a通过特异性结合PKLR 3'UTR调控其表达。

图2：miR-130a过表达对PKLR表达和HCV复制的抑制作用

本研究通过在Huh7.5.1细胞和原代人肝细胞(PHHs)中转染miR-130a模拟物或阴性对照模拟物，发现miR-130a过表达能够显著增加miR-130a水平(A)，同时降低PKLR mRNA水平(B)，并且在PHHs中也观察到类似现象(E、F)。此外，miR-130a过表达显著降低了PKLR和HCV核心蛋白水平(D)，并显著抑制了HCV RNA水平(G)，但对细胞活力无显著影响(C、H)。这些结果表明，miR-130a过表达可通过抑制PKLR表达来抑制HCV复制。

图3：miR-130a抑制或敲低对PKLR表达及HCV复制的影响

本研究通过使用miR-130a抑制剂和CRISPR/Cas9 miR-130a gRNA，探讨了miR-130a在HCV复制中的作用。实验中，miR-130a抑制剂和miR-130a gRNA被分别转染到Huh7.5.1细胞中，并在适当孔中接种HCV JFH1病毒，培养48小时。结果显示，miR-130a gRNA能够显著降低miR-130a水平(A)，同时增加PKLR mRNA水平(B)，促进HCV RNA复制(C)，并提高PKLR和HCV核心蛋白水平(D)。此外，miR-130a gRNA或miR-130a抑制剂均未对细胞活力产生显著影响(E)。miR-130a抑制剂同样能够降低miR-130a水平(F)，增加PKLR mRNA水平(G)，并促进HCV RNA复制(H)。这些结果表明，miR-130a的抑制或敲低能够通过上调PKLR表达来促进HCV复制。

图4：miR-130a过表达抑制PKLR表达及HBV复制

本研究通过在HepAD38细胞和原代人肝细胞(PHHs)中转染miR-130a模拟物或阴性对照模拟物，探讨了miR-130a对HBV复制的影响。实验结果显示，miR-130a模拟物能够显著增加miR-130a水平(A)，同时降低PKLR mRNA水平(B)。此外，miR-130a模拟物对HepAD38细胞中的HBV cccDNA水平无显著影响(C)，但能够显著抑制细胞上清中的HBV DNA水平(D)和HepAD38细胞中的HBV DNA水平(E)，且对细胞活力无显著影响(F)。在PHHs中，miR-130a模拟物能够以时间依赖性方式降低上清中的HBV DNA水平(H)，抑制HBV cccDNA(I)和总HBV DNA水平(J)，并降低PKLR和HBV核心蛋白水平(G)。这些结果表明，miR-130a过表达通过抑制PKLR表达，能够有效抑制HBV的复制。

图5：miR-130a敲低增加PKLR表达及HBV复制

本研究通过在HepAD38细胞中转染miR-130a gRNA或阴性对照gRNA，探讨了miR-130a敲低对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。实验结果显示，miR-130a gRNA能够显著降低miR-130a水平(A)，同时增加PKLR mRNA水平(B)，促进细胞上清中HBV DNA水平(C)和HepAD38细胞中HBV DNA水平(D)的上升，但对HBV cccDNA水平无显著影响(E)。此外，miR-130a gRNA未显著影响HepAD38细胞的活力(F)，但增加了PKLR和HBcAg蛋白水平(G)。这些结果表明，miR-130a的敲低可以通过上调PKLR表达来促进HBV的复制。

图6：PKLR对HCV复制的调控作用

在Huh7.5.1细胞中，PKLR过表达可促进HCV复制，但不影响细胞活力。PKLR gRNA能降低PKLR mRNA水平，抑制HCV RNA复制和核心蛋白水平，但不影响miR-130a表达和细胞活力。这表明PKLR是HCV复制的正向调控因子。

图7：PKLR对HBV复制的调控

PKLR过表达增加HepAD38细胞上清中的HBV DNA水平(A)。PKLR gRNA在HBV感染的NTCP-Huh7.5.1细胞中显著降低HBV DNA水平(B、C)和cccDNA水平(D)，表现出时间依赖性。结果表明PKLR可促进HBV复制，其敲低则抑制HBV复制。

图8：丙酮酸补充可逆转miR-130a模拟物对HCV和HBV复制的抑制作用

实验表明，丙酮酸补充能够逆转miR-130a模拟物对HCV和HBV复制的抑制作用。具体结果如下：

1.丙酮酸对细胞活力无显著影响：丙酮酸未显著影响Huh7.5.1细胞及HCV感染细胞的活力(A)。

2.丙酮酸剂量依赖性地增加HCV复制：在HCV感染的细胞中，丙酮酸补充以剂量依赖性方式增加HCV复制(B)。

3.丙酮酸不影响miR-130a和PKLR mRNA水平：丙酮酸补充未影响miR-130a(C)和PKLR mRNA的表达(D)。

4.丙酮酸逆转miR-130a模拟物对HCV RNA和核心蛋白水平的抑制：丙酮酸补充(5 mM)可显著逆转miR-130a模拟物对HCV RNA(E)和HCV核心蛋白水平(F)的抑制作用。

5.丙酮酸逆转miR-130a模拟物对HBV复制的抑制：丙酮酸补充(5 mM)可显著逆转miR-130a模拟物对HBV cccDNA(H)和HBV DNA(I)水平的抑制作用。

图9：丙酮酸补充(5 mM)逆转PKLR gRNA对HCV和HBV复制的抑制作用

实验表明，丙酮酸补充(5 mM)能够逆转PKLR gRNA对HCV和HBV复制的抑制作用：

1.丙酮酸逆转PKLR gRNA对HCV复制的抑制：在HCV感染的细胞中，丙酮酸补充(5 mM)可显著逆转PKLR gRNA对HCV RNA复制(A)和HCV核心蛋白水平(C)的抑制作用。

2.丙酮酸不影响PKLR mRNA和miR-130a表达：丙酮酸补充(5 mM)未显著影响PKLR mRNA(B)和miR-130a的表达(D)。

3.丙酮酸对细胞活力无显著影响：丙酮酸补充(5 mM)未显著影响HCV感染细胞的活力(E)。

4.丙酮酸逆转PKLR gRNA对HBV复制的抑制：在HBV感染的NTCP-Huh7.5.1细胞中，丙酮酸补充(5 mM)可显著逆转PKLR gRNA对HBV DNA水平(F)、cccDNA复制(G)和HBV DNA复制(H)的抑制作用。

这些结果表明，丙酮酸补充能够通过代谢途径调节，逆转PKLR gRNA对HCV和HBV复制的抑制作用。

研究结论

本研究通过生物信息学预测和实验验证发现，miR-130a能够直接靶向PKLR基因，显著下调其表达。在HCV和HBV感染模型中，miR-130a过表达抑制了PKLR的mRNA和蛋白水平，并显著降低HCV和HBV的复制水平;而miR-130a的敲低则促进病毒复制。此外，丙酮酸补充能够逆转miR-130a或PKLR gRNA对HCV和HBV复制的抑制作用，表明PKLR及其代谢产物丙酮酸在病毒复制中发挥关键作用。