肾透明细胞癌中铜中毒相关MiR-21-5p/FDX1轴及其对肿瘤微环境的潜在影响

基本信息

英文标题：Cuproptosis-related MiR-21-5p/FDX1 axis in clear cell renal cell carcinoma and its potential impact on tumor microenvironment

中文标题：肾透明细胞癌中铜中毒相关MiR-21-5p/FDX1轴及其对肿瘤微环境的潜在影响

发表期刊：《Cells》

影响因子：6

作者单位：西南医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系、西南医科大学附属医院泌尿外科等

作者信息：Mingyue Xie ，Bo Cheng ，Shuang Yu ，et al.

研究背景

细胞死亡的分子调控

细胞死亡在人体内受到精确的分子调控，包括凋亡、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡等已知方式。

最近发现一种新型细胞死亡方式——铜死亡(cuproptosis)，由铜离子载体介导，且无法被现有细胞死亡抑制剂阻断。

铜死亡的机制

铜死亡与铜离子浓度和蛋白质脂酰化密切相关。

过量铜离子结合脂酰化蛋白，导致蛋白聚集、铁硫簇蛋白丢失，引发蛋白毒性应激和细胞死亡。

已鉴定出10个与铜死亡相关的基因，其中7个促进铜死亡，3个抑制铜死亡。

FDX1的核心作用

FDX1是铜死亡的主要调控因子，通过将Cu2+还原为有毒的Cu1+，并调控蛋白质脂酰化，促进铜死亡。

FDX1在多种癌症(如膀胱癌、肝癌、黑色素瘤和乳腺癌)中具有预后指示作用。

透明细胞肾细胞癌(ccRCC)的背景

ccRCC占肾癌的80%，主要由VHL基因失活引起。

VHL失活导致HIF-1α和HIF-2α积累，促进肿瘤生长、转移和新血管生成。

尽管已有靶向药物(如舒尼替尼和帕唑帕尼)，但细胞死亡抗性限制了疗效。

研究目的与发现

研究探讨铜死亡调控因子的临床价值及FDX1在ccRCC中的作用。

对铜死亡敏感的患者生存期更长，可能与CD4+ T细胞浸润有关。

FDX1抑制ccRCC细胞生长和侵袭，其表达与T分期、肿瘤分级和CD4+ T细胞浸润相关。

FDX1受到miR-21-5p的转录后调控，miR-21-5p通过直接结合降低FDX1表达。

miR-21-5p/FDX1轴与ccRCC微环境中的免疫细胞浸润密切相关。

结论与意义

miR-21-5p/FDX1轴介导的铜死亡抗性及其调控的肿瘤微环境是ccRCC进展的潜在机制。

恢复铜死亡可能成为治疗ccRCC的替代策略。

研究方法

数据收集

从癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合数据库(GEO)下载RNA测序数据集及相关临床信息。

从UCSC Xena获取DNA甲基化数据集(KIRC，Illumina Human 450)。

生物信息学分析

使用“survival” R包评估TCGA-KIRC中ccRCC患者的总生存期。

使用“tinyarray” R包将TCGA样本分为“肿瘤”组和“正常”组。

使用“ConsensusClusterPlus” R包将TCGA KIRC样本分为两个聚类，并通过主成分分析(PCA)和t-SNE分析进行可视化。

通过多变量Cox回归分析生成铜死亡风险评分，并根据最优截断点将患者分为高评分组和低评分组。

使用GO和KEGG进行功能富集分析，并通过GSEA软件进行基因集富集分析。

使用“minfi”包对DNA甲基化数据进行标准化，并可视化铜死亡调控因子的启动子区域甲基化水平。

使用CIBERSORT算法和LM22特征矩阵评估免疫细胞浸润水平。

细胞培养

使用VHL缺失型(OSRC-2)和VHL野生型(ACHN)肾癌细胞系，在10% FBS DMEM培养基中培养。

siRNA转染

使用lipofectamine 3000转染试剂将针对FDX1的siRNA转染至细胞中，siRNA序列由通用生物公司提供。

蛋白质印迹(Western Blotting)

使用RIPA缓冲液裂解细胞，通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移到尼龙膜上，使用FDX1抗体进行检测。

实时定量PCR(RT-qPCR)

使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过逆转录和SYBR Green染料进行实时定量PCR检测FDX1表达。

CCK8实验

将RCC细胞接种于96孔板中，使用CCK8试剂盒检测细胞活力。

Transwell侵袭实验

使用Matrigel包被Transwell上室，将RCC细胞接种于上室中，16小时后固定并染色，计算侵袭细胞数量。

铜离子检测

使用铜比色法检测OSRC-2细胞中的Cu2+水平，基于580 nm吸光度值绘制标准曲线。

免疫组织化学染色(IHC)

对ccRCC组织切片进行脱蜡、抗原修复和封闭处理，使用FDX1和CD4抗体进行染色，并通过DAB显色检测信号。

实验结果

图A展示了ccRCC与正常肾组织中铜死亡调控因子的表达水平差异。

图B比较了ccRCC与正常肾组织中铜死亡调控因子启动子区域的甲基化水平。

图C显示，FDX1高表达的ccRCC患者生存期更长(Kaplan-Meier生存分析)。

图D至图I分别展示了DLAT、DLD、PDHB、LIAS、LIPT1和PDHA1高表达的ccRCC患者生存期显著延长(Kaplan-Meier生存分析)。

图中标注了显著性水平：* p < 0.05，*** p < 0.001，**** p < 0.0001;n.s.表示无显著性差异。

图A展示了类别数k的累积分布函数(CDF)和delta区域分析结果。

图B显示了当k=2时的共识矩阵。

图C通过主成分分析(PCA)对铜死亡敏感组(CSS)和铜死亡抵抗组(CRS)进行了分析。

图D展示了CSS和CRS中铜死亡调控因子的表达热图。

图E比较了CSS和CRS患者的临床病理特征。

图F显示，CSS患者的生存期显著长于CRS患者。

图G展示了CSS患者中免疫细胞的估计比例。

图H展示了CRS患者中免疫细胞的估计比例。

图I比较了CSS和CRS患者之间的免疫细胞浸润情况。

图中标注了显著性水平：* p < 0.05，*** p < 0.001，**** p < 0.0001;n.s.表示无显著性差异。

图A展示了七个铜死亡调控因子的多变量Cox回归分析结果。

图B显示，铜死亡评分高的患者生存期显著长于铜死亡评分低的患者。

图C在另一个独立数据集中验证了铜死亡风险评分的适用性。

图D通过AUC分析评估了图C的结果。

图E展示了CD4+ T记忆静息细胞数量与铜死亡风险评分之间的相关性。

图F展示了调节性T细胞(Treg)数量与铜死亡风险评分之间的相关性。

图A通过Western blotting检测了10对ccRCC样本中FDX1的表达水平。

图B展示了ccRCC组织微阵列中FDX1的免疫组织化学(IHC)染色结果(27/62例ccRCC样本及其配对癌旁组织)。左图为IHC染色的代表性图像，右图为IHC染色的统计分析。比例尺：左图200 µm，右图100 µm。

图C和图D分别通过qPCR(C)和Western blotting(D)验证了OSRC-2细胞中FDX1的敲低效率。

图E显示，敲低FDX1显著促进了OSRC-2和ACHN细胞的生长。

图F显示，敲低FDX1显著增强了OSRC-2和ACHN细胞的侵袭能力。左图为侵袭细胞的代表性图像，右图为侵袭细胞的统计分析。比例尺：100 µm。

图G显示，GSEA分析表明JAK-STAT信号通路在FDX1低表达的ccRCC患者中富集(上图);FDX1 siRNA激活了OSRC-2细胞中的STAT3信号通路(下图)。GAPDH作为内参对照。

图中标注了显著性水平：* p < 0.05，** p < 0.01，**** p < 0.0001。

图A展示了不同组织学T分期的ccRCC样本中FDX1的IHC染色代表性图像。比例尺：上图200 µm，下图100 µm。

图B展示了不同分级的ccRCC样本中FDX1的IHC染色代表性图像。比例尺：上图200 µm，下图100 µm。

图C显示，组织学T分期

图D显示，FDX1 IHC评分与ccRCC中CD4+ T细胞浸润呈正相关(r = 0.2662，p = 0.03，n = 62)。

图E展示了FDX1表达强度与CD4+ T细胞浸润相关性的代表性图像。比例尺：上图200 µm，下图100 µm。

图F通过TIMER 2.0对TCGA-KIRC数据集的免疫细胞浸润分析显示，FDX1表达与CD4+和CD8+ T细胞数量呈正相关。

图A展示了正常肾组织与ccRCC之间差异表达的miRNA热图。

图B通过基于预后的LASSO分析筛选了差异miRNA。

图C列出了14个与预后高度相关的miRNA。

图D通过维恩图展示了14个miRNA与FDX1靶向miRNA的交集。

图E显示，miR-21-5p高表达与ccRCC患者较短的总生存期相关。

图F展示了FDX1的3'-UTR与miR-21-5p的预测结合位点(上图)，以及miR-21-5p抑制剂处理显著提高了ACHN和OSRC-2细胞中FDX1的表达(下图)。GAPDH作为内参对照。

图G通过荧光素酶报告实验显示，miR-21-5p模拟物显著抑制了FDX1 3'-UTR的活性。

图H显示，miR-21-5p抑制剂抑制ACHN和OSRC-2细胞生长的作用可被FDX1敲低所逆转。

图I显示，miR-21-5p抑制剂抑制OSRC-2细胞侵袭的作用可被FDX1敲低所阻断。左图为侵袭细胞的代表性图像，右图为统计分析。比例尺：100 µm。

图J展示了miR-21-5p抑制剂或siFDX1处理前后OSRC-2细胞中Cu2+水平的变化。

图K显示，TCGA-KIRC数据集中miR-21-5p表达与FDX1呈负相关。

图A展示了miR-21-5p低表达的ccRCC患者中肿瘤微环境成分的估计比例。

图B展示了miR-21-5p高表达的ccRCC患者中肿瘤微环境成分的估计比例。

图C比较了miR-21-5p高表达与低表达ccRCC患者之间肿瘤微环境成分的差异。

图D展示了miR-21-5p/FDX1轴与免疫检查点之间的相关性。

研究结论

● 铜死亡与ccRCC：铜死亡特征及其相关肿瘤微环境的预后价值已被认识，FDX1在ccRCC中具有肿瘤抑制作用。铜死亡抵抗患者生存率较低，临床病理特征较差。

● miR-21-5p/FDX1轴：研究发现miR-21-5p调控FDX1表达，miR-21-5p/FDX1轴与ccRCC微环境中的免疫细胞浸润(尤其是CD4+ T细胞)密切相关，FDX1具有铜死亡依赖性和独立性的肿瘤抑制功能。

● 癌细胞抗死亡机制：癌细胞通过高表达Bcl-2等机制抵抗凋亡，某些肿瘤细胞低表达焦亡相关基因(如DFNA5和GSDME)，使其对焦亡诱导的细胞死亡不敏感。

● FDX1的调控与治疗潜力：ccRCC肿瘤中FDX1表达显著降低，miR-21-5p抑制剂可能具有治疗价值。此外，表观遗传调控(如DNA甲基化)和其他机制(如RNA修饰)可能影响铜死亡调控因子的表达。

FDX1的铜死亡独立性功能：敲低FDX1增加ccRCC细胞的侵袭性，并激活STAT3信号通路，表明FDX1可能通过非铜死亡途径影响肿瘤进展。

总结与治疗前景：研究揭示了miR-21-5p/FDX1轴在ccRCC中的作用，针对该轴的干预可能成为ccRCC治疗的新策略。