抑制circ_znf512介导的miR-181d-5p通过EGR1/mTORC1通路限制心肌细胞自噬，促进心肌缺血/再灌注损伤

基本信息

英文标题：Circ_ZNF512-mediated miR-181d-5p inhibition limits cardiomyocyte autophagy and promotes myocardial ischemia/reperfusion injury through an EGR1/mTORC1 pathway

中文标题：抑制circ_znf512介导的miR-181d-5p通过EGR1/mTORC1通路限制心肌细胞自噬，促进心肌缺血/再灌注损伤

发表期刊：《Journal of Medicinal Chemistry》

影响因子：7.3

作者单位：郑州大学第一附属医院、天津医科大学生理学与病理生理学教研室

作者信息：Chen Huang，Liliang Shu，Hualu Zhang，Xiaohua Zhu，Gongcheng Huang，Jing Xu.

研究背景

● 心肌缺血/再灌注(I/R)损伤是全球最致命的心血管疾病之一。

● Circular RNAs (circRNAs) 是内源性转录本，在多种生物、发育阶段和病理条件下表达。

● circRNAs 被证实参与心血管疾病的发病机制，包括I/R损伤和心肌梗死。

● circRNAs 在这些疾病中被视为潜在的治疗靶点。

研究方法

● 微阵列基因表达谱 从GEO数据库中检索到与心肌I/R损伤相关的mRNA数据集GSE4105和miRNA数据集GSE50885。构建了小鼠心肌I/R损伤模型，并对心肌组织进行了circRNA测序。

● 小鼠心肌I/R损伤模型的建立 使用了104只雄性C57BL/6小鼠，其中88只用于构建心肌I/R损伤模型，76只建模成功，其余16只进行了假手术。

● 心肌组织circRNA测序 建立了两个小鼠心肌I/R损伤模型用于测序，并使用两个正常心脏样本作为对照。

● 心脏功能指数测定 建模后7天，通过超声检测小鼠的心脏功能指数。

● Evans Blue/TTC双重染色 通过Evans Blue/TTC双重染色来确定心肌缺血和梗死的面积。

● HE染色 对石蜡包埋的心肌组织进行HE染色，以观察组织结构。

● 透射电镜(TEM) 使用透射电镜观察小鼠心肌组织的超微结构。

● H/R细胞模型的开发和细胞处理 从1-2天大的C57BL/6小鼠中分离出心肌细胞，并在缺氧/复氧条件下处理。

● 免疫荧光检测 通过免疫荧光检测LC3荧光斑点的数量和分布。

● Hoechst 33258染色 使用Hoechst 33258染色来观察细胞核形态。

● 双荧光素酶报告基因检测 通过双荧光素酶报告基因检测来验证circ_ZNF512和miR-181d-5p之间的结合。

● 细胞质/核分离试验 使用PARIS试剂盒分离细胞质和核成分。

● RIP实验 使用RIP试剂盒来分析circ_ZNF512/miR-181d-5p和Ago2的结合。

● RNA下拉实验 通过RNA下拉实验来检测circ_ZNF512的富集。

● RNA分离和定量 从心肌组织和细胞中分离并定量总RNA。

● Western Blot分析 通过Western Blot分析来检测蛋白表达。

实验结果

图1： I/R小鼠心肌组织和H/R诱导细胞中EGR1表达的升高

(A) GSE4105数据集中与心肌I/R损伤相关的差异表达mRNA火山图。黑色点表示没有显著差异的基因，红色点表示显著上调的基因，绿色点表示显著下调的基因。

(B) GSE4105数据集中前50个基因的热图。

(C) GSE4105数据集中EGR1表达数据的箱型图。左侧的蓝色箱表示对照组样本的表达，右侧的红色箱表示心肌I/R损伤样本的表达。

(D) 通过超声心动图检测的心脏功能相关指标(LVESD和LVEDD)。

(E) I/R小鼠心肌组织的Evans Blue/TTC双重染色。

(F) 通过RT-qPCR和Western Blot分析I/R小鼠心肌组织中EGR1的mRNA和蛋白表达。

(G) 通过RT-qPCR和Western Blot分析确定的H/R诱导细胞中EGR1的mRNA和蛋白表达。*与假手术小鼠或对照组细胞相比，p < 0.05。每组小鼠n=8。

实验独立进行了三次。

图2：敲除EGR1增强体外心肌细胞自噬并阻碍凋亡

(A) 通过RT-qPCR在心肌细胞中验证sh-EGR1-1、sh-EGR1-2和sh-EGR1-3序列的沉默效率。

(B) 通过Western Blot分析在心肌细胞中验证sh-EGR1-1、sh-EGR1-2和sh-EGR1-3序列的沉默效率。

(C) 通过免疫荧光GFP-LC3实验检测转染sh-EGR1的心肌细胞中自噬体的形成。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞核为蓝色，GFP-LC3信号为绿色。

(D) 通过Western Blot分析在转染sh-EGR1的心肌细胞中检测LC3II/LC3I和p62的蛋白表达。

(E) 通过RT-qPCR分析在转染sh-EGR1的心肌细胞中检测LC3II/LC3I和p62的mRNA表达。

(F) 通过Hoechst 33258染色评估转染sh-EGR1的心肌细胞的凋亡情况。

(G) 通过Western Blot分析在心肌细胞中检测与凋亡相关的基因(Cas3、Cas9、Bax和Bcl-2)的蛋白表达。

(H) 通过RT-qPCR分析在心肌细胞中检测与凋亡相关的基因(Cas3、Cas9、Bax和Bcl-2)的mRNA表达。*与转染sh-NC的心肌细胞相比，p < 0.05。

实验独立进行了三次。

图3：敲除EGR1增强I/R小鼠心肌细胞的自噬，从而延迟心肌损伤

(A) 通过RT-qPCR在小鼠心肌组织中验证sh-EGR1-1、sh-EGR1-2和sh-EGR1-3序列的沉默效率。

(B) 通过Western Blot分析在小鼠心肌组织中验证sh-EGR1-1、sh-EGR1-2和sh-EGR1-3序列的沉默效率。

(C) 通过超声心动图检测在sh-EGR1处理的I/R小鼠中心脏功能的相关指标。

(D) 通过Evans Blue/TTC双重染色观察sh-EGR1处理的I/R小鼠心肌组织的梗死面积。

(E) 通过HE染色观察sh-EGR1处理的I/R小鼠心肌组织的病理变化。

(F) 通过透射电镜(TEM，20 000×)观察sh-EGR1处理的I/R小鼠心肌组织中线粒体的肌丝结构。

(G) 通过Western Blot分析检测sh-EGR1处理的I/R小鼠心肌组织中LC3II/LC3I和p62的蛋白表达。*与假手术小鼠或sh-NC处理的相比，p < 0.05。每组小鼠n=8。

实验独立进行了三次。

图4：EGR1是心肌细胞中miR-181d-5p的靶基因

(A) GSE50885数据集中与心肌I/R损伤相关的差异表达miRNA火山图。黑色点表示没有显著差异的miRNA，红色点表示显著上调的miRNA，绿色点表示显著下调的miRNA。

(B) GSE50885数据集中前50个miRNA的热图。

(C) 通过TargetScan和starBase数据库预测的EGR1的上游miRNA与GSE50885数据集中下调的miRNA的韦恩图分析。

(D) GSE50885数据集中miR-181d-5p表达数据的箱型图。左侧的蓝色箱表示对照组样本的表达，右侧的红色箱表示心肌I/R损伤样本的表达。

(E) starBase数据库预测的人类和小鼠中miR-181d-5p与EGR1的结合位点。

(F) 在293T细胞中通过双荧光素酶报告基因检测验证miR-181d-5p与EGR1的结合。

(G) 通过RT-qPCR检测转染miR-181d-5p模拟物或抑制剂的心肌细胞中EGR1的表达。

(H) 通过Western Blot检测转染miR-181d-5p模拟物或抑制剂的心肌细胞中EGR1的蛋白表达。

(I) I/R小鼠心肌组织和H/R诱导细胞中miR-181d-5p的表达。*与转染 mimic-NC 的293T细胞、转染 mimic-NC 或 inhibitor-NC 的心肌细胞、假手术小鼠或对照组细胞相比，p < 0.05。

实验独立进行了三次。

图5：miR-181d-5p通过靶向EGR1在体外和体内促进心肌细胞自噬并改善心肌损伤

(A) 通过免疫荧光GFP-LC3实验检测转染oe-EGR1或与miR-181d-5p模拟物联合处理的心肌细胞中自噬体的形成。

(B) 通过Western Blot分析检测转染oe-EGR1或与miR-181d-5p模拟物联合处理的心肌细胞中LC3II/LC3I和p62的蛋白表达。

(C) 通过Hoechst 33258染色评估转染oe-EGR1或与miR-181d-5p模拟物联合处理的心肌细胞的凋亡情况。

(D) 通过Evans Blue/TTC双重染色观察I/R小鼠心肌组织在处理oe-EGR1或与miR-181d-5p agomiR联合处理后的梗死面积。

(E) 通过HE染色观察I/R小鼠心肌组织在处理oe-EGR1或与miR-181d-5p agomiR联合处理后的病理变化。

(F) 通过Western Blot分析检测I/R小鼠心肌组织在处理oe-EGR1或与miR-181d-5p agomiR联合处理后的LC3II/LC3I和p62的蛋白表达。*与转染mimic-NC + oe-NC或mimic-NC + oe-EGR1的小鼠心肌细胞相比，或与处理agomiR-NC + oe-NC或agomiR-NC + oe-EGR1的I/R小鼠相比，p < 0.05。每组小鼠n=8。

实验独立进行了三次。

图6：circ_ZNF512与miR-181d-5p竞争性结合并上调EGR1的表达

(A) 序列数据集中与心肌I/R损伤相关的差异表达circRNA火山图。黑色点表示没有显著差异的circRNA，红色点表示显著上调的circRNA，绿色点表示显著下调的circRNA。

(B) 序列数据集中前50个circRNA的热图。

(C) 序列数据集中mmu_circ_0012534表达数据的箱型图。左侧的蓝色箱表示对照组样本的表达，右侧的红色箱表示心肌I/R损伤样本的表达。

(D) RNA22数据库预测的circ_ZNF512与miR-181d-5p在人类和小鼠中的结合位点。

(E) 通过琼脂糖凝胶电泳检测circ_ZNF512在cDNA和gDNA中的扩增。

(F) 通过细胞质/核分离试验分析circ_ZNF512的亚细胞定位。GAPDH作为细胞质标记，U6作为核标记。

(G) 通过双荧光素酶报告基因检测验证circ_ZNF512与miR-181d-5p的结合。

(H) 通过RIP实验评估circ_ZNF512与miR-181d-5p的结合。

(I) 通过RNA下拉实验评估circ_ZNF512与miR-181d-5p的结合。

(J) 通过RT-qPCR检测I/R小鼠心肌组织和H/R诱导细胞中circ_ZNF512的表达。

(K) 通过RT-qPCR检测转染sh-circ_ZNF512的细胞中miR-181d-5p和EGR1的表达。*与假手术小鼠、对照组细胞或转染sh-NC的细胞或处理Bio-probe NC或IgG的细胞相比，p < 0.05。

实验独立进行了三次。

图7：circ_ZNF512与miR-181d-5p竞争性结合并上调EGR1的表达，促进细胞自噬并减轻心肌损伤

(A) 通过免疫荧光GFP-LC3实验检测转染sh-circ_ZNF512或与miR-181d-5p抑制剂联合处理的心肌细胞中自噬体的形成。

(B) 通过Western Blot分析检测转染sh-circ_ZNF512或与miR-181d-5p抑制剂联合处理的心肌细胞中LC3II/LC3I和p62的蛋白表达。

(C) 通过Hoechst 33258染色评估转染sh-circ_ZNF512或与miR-181d-5p抑制剂联合处理的心肌细胞的凋亡情况。

(D) 通过Evans Blue/TTC双重染色观察I/R小鼠心肌组织在处理sh-circ_ZNF512或与miR-181d-5p antagomiR联合处理后的梗死面积。

(E) 通过HE染色观察I/R小鼠心肌组织在处理sh-circ_ZNF512或与miR-181d-5p antagomiR联合处理后的病理变化。

(F) 通过Western Blot分析检测I/R小鼠心肌组织在处理sh-circ_ZNF512或与miR-181d-5p antagomiR联合处理后的LC3II/LC3I和p62的蛋白表达。*与转染sh-NC + inhibitor-NC或sh-circ_ZNF512 + inhibitor-NC的细胞相比，或与处理sh-NC + antagomiR-NC或sh-circ_ZNF512 + antagomiR-NC的I/R小鼠相比，p < 0.05。每组小鼠n=8。

实验独立进行了三次。

图8：circ_ZNF512/miR-181d-5p/EGR1交互作用激活心肌细胞中的mTORC1/TFEB信号通路

(A) 通过Western Blot分析确定I/R小鼠心肌组织中mTORC1和TFEB的表达。

(B) 通过Western Blot分析确定H/R诱导的心肌细胞中mTORC1和TFEB的表达。

(C) 通过Western Blot分析确定H/R诱导的心肌细胞在处理sh-circ_ZNF512后的mTORC1和TFEB的表达。

(D) 通过Western Blot分析确定H/R诱导的心肌细胞在处理sh-circ_ZNF512、sh-circ_ZNF512 + miR-181d-5p抑制剂、miR-181d-5p模拟物或miR-181d-5p模拟物 + oe-EGR1后的EGR1、mTORC1和TFEB的表达。*与假手术小鼠、对照组细胞、转染sh-NC的细胞、sh-circ_ZNF512 +抑制剂-NC或miR-181d-5p模拟物 + oe-NC的细胞相比，p < 0.05。

实验独立进行了三次。

图9. 心肌I/R损伤中circ_ZNF512沉默保护作用的分子机制

circ_ZNF512的沉默减弱了其与miR-181d-5p的竞争性结合，从而下调了miR-181d-5p靶基因EGR1的表达。

circ_ZNF512的沉默激活了mTORC1/TFEB信号通路，从而促进了心肌细胞自噬。

通过促进心肌细胞自噬，circ_ZNF512的沉默预防了心肌I/R损伤。

研究结论

● 当前研究表明，circ_ZNF512的沉默能够促进心肌细胞自噬并保护心脏免受I/R损伤。

● 这种保护作用可能与miR-181d-5p的上调、EGR1基因的下调以及mTORC1/TFEB信号通路的激活有关。

● circ_ZNF512/miR-181d-5p/EGR1/mTORC1/TFEB轴可能是心肌I/R损伤的未来治疗策略。

● 需要进一步研究mTORC1/TFEB信号通路在心肌细胞自噬和心肌I/R损伤中的作用，以验证研究的发现。