生物发光和PET分子成像揭示病毒溶瘤动力学和肿瘤活性

Fluc细胞是经过基因工程改造后能够表达萤火虫荧光素酶的细胞，因其高灵敏度、低背景干扰、蛋白稳定性强和耐热性而在生物医学研究和药物开发中被广泛应用。这些细胞不仅能够用于验证miRNA与mRNA、lncRNA、circRNA之间的相互作用，还能动态监控肿瘤生长和转移，以及研究CAR-T细胞治疗的效果。Fluc细胞的高灵敏度和稳定性减少了对样本的侵入性，保持了细胞或组织的天然状态，而其快速反应和低背景发光特性，预示着在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。随着技术的发展，Fluc细胞的应用将进一步扩展，为疾病研究和治疗提供更多可能性。

基本信息

英文标题：Molecular imaging with bioluminescence and PET reveals viraloncolysis kinetics and tumor viability

中文标题：生物发光和PET分子成像揭示病毒溶瘤动力学和肿瘤活性

发表期刊：《Cancer Res》

影响因子：12.5

作者单位：

1.Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Boston, MA

2.Department of Radiology, Massachusetts General Hospital, Boston, MA

作者信息：

Darshini Kuruppu, Anna-Liisa Brownell, Khalid Shah, Umar Mahmood, Kenneth K. Tanabe

研究背景

病毒溶瘤，即通过复制病毒破坏癌细胞，是一种仍在探索中的实验性癌症治疗方法。这种疗法的治疗范式涉及在癌细胞中连续的溶裂复制波。目前，监测复制位点的病毒滴度需要活检。然而，重复的连续活检在实际中并不可行，无法用于患者体内病毒复制和肿瘤反应的时间监测。分子成像提供了一种非侵入性方法，可以实时识别细胞内的病毒基因表达。本研究通过生物发光和正电子发射断层扫描(PET)顺序成像病毒溶瘤和肿瘤对溶瘤的反应，揭示了肿瘤异种移植物中这两个过程的动力学。研究结果表明，病毒复制周期可以被识别为在初始病毒肿瘤感染高峰后约2天出现的连续报告基因表达波。这些波对应于复制周期后释放的病毒颗粒。病毒和细胞动力学分别通过Fluc和Rluc生物发光报告基因以及两种18F标记的PET报告基因(FHBG，9-(4-18F-氟-3-[羟甲基]丁基)鸟嘌呤)和(FLT，18F-3'-脱氧-3-氟胸苷)进行成像。对肿瘤异种移植物切片的关联免疫组化确认了体内结果。本研究发现，PET可以用于识别病毒复制周期，并实时测量肿瘤内复制病毒的水平。这种非侵入性成像方法在监测患者体内的病毒溶瘤治疗中具有潜在的应用价值。

研究方法

本研究开发了用于生物发光成像的稳定细胞系，通过慢病毒载体将Rluc和mCherry基因及嘌呤霉素抗性基因导入人类和小鼠癌症细胞系。细胞系经过认证和污染检测，通过嘌呤霉素筛选获得稳定表达Rluc的细胞株。同时，研究生成了表达Fluc的复制条件HSV-1突变体HSV-Luc，用于体外和体内病毒复制的生物发光成像。通过荧光素酶和[18F]FHBG-PET测量病毒复制，建立了侧腹肿瘤模型，并利用双重Fluc和Rluc生物发光及microPET技术对病毒和肿瘤进行体内成像。此外，通过LacZ染色和免疫组化方法在冷冻肿瘤切片中识别病毒，评估了HSV-TK、PCNA表达以及细胞凋亡情况。这些方法为监测病毒溶瘤治疗提供了非侵入性成像手段。

实验结果

图1：分子报告基因、细胞和病毒的示意图特征

A部分：双重生物发光检测系统基于Fluc和Rluc的酶促反应，其中荧光素和coelenterazine分别作为底物。PET配体[18F]FHBG作为HSV-TK的底物，被磷酸化并困在细胞内。

B部分：表达Rluc和mCherry的稳定癌细胞系可以通过Rluc生物发光和mCherry荧光进行识别。图中展示了体外成像Rluc的转化MC26细胞。C部分：HSV-Luc表达Fluc和TK基因。在体外，通过Fluc生物发光在C26细胞中识别复制的病毒(MC26+HSV-Luc)，其信号与瞬时表达Fluc的MC26细胞(MC26-Fluc)相当。通过PET示踪剂[18F]FHBG在体外检测MC26细胞中复制的病毒(MC26+hrR3)，其信号与瞬时表达TK基因的MC26细胞(MC26sr39TK)相当。

图2：体外病毒和细胞动力学研究

A部分：研究了HSV-Luc在MC26细胞中的复制动力学，使用Fluc生物发光进行检测。在高病毒滴度(1×108、1×107和1×106 pfu)时，Fluc信号出现了两个峰值(箭头所示)，而在低病毒滴度下信号无法检测。Fluc信号以平均净强度/面积±标准差表示。B部分：研究了病毒感染后MC26细胞的存活率。当用高病毒滴度(1×108、1×107和1×106 pfu)感染时，细胞计数减少。细胞计数以平均值±标准差表示。C部分：展示了HSV-Luc(1×108 pfu)感染后24小时MC26细胞和Vero细胞对[18F]FHBG的摄取情况。数据以[18F]FHBG摄取/细胞的平均百分比±标准差表示。D部分：研究了病毒感染后MC26细胞和Vero细胞浓度的变化。与未感染病毒的细胞相比，MC26细胞浓度显著降低。细胞浓度以平均值±标准差表示。

图3：病毒复制动力学的体内成像研究

A部分：研究了侧腹肿瘤中病毒复制的动力学，使用荧光素酶(Fluc)生物发光技术。Fluc信号表现出3个峰值(箭头所示)，这些峰值随时间逐渐减弱。Fluc信号以每单位面积的平均净强度加标准差(SD)表示。

B部分：则通过[18F]FHBG-PET成像技术研究病毒复制的动力学。在高病毒滴度(1×108 pfu)的情况下，肿瘤对[18F]FHBG的摄取在6小时(0.3天)达到峰值(箭头所示)，随后逐渐下降。而在较低病毒滴度(1×106 pfu)的情况下，[18F]FHBG摄取在3天时再次达到峰值。最低病毒滴度(1×103 pfu)则未检测到信号。放射性标记摄取以每单位体积注射剂量的百分比的平均值加标准差(SD)表示。

图4：Rluc生物发光成像的肿瘤生长与卡尺测量体积的相关性

在双侧MDA-MB-231-Rluc侧腹肿瘤的扫描图像中，Rluc信号区域随时间增加(A)。Rluc信号强度增强，并与卡尺测量的肿瘤体积相对应(B)。在A2058-Rluc(C，D)和HT29-Rluc(E，F)侧腹肿瘤中也观察到类似的现象，即Rluc信号的增加与卡尺测量的肿瘤体积相关。数据以平均值±标准误(SEM)表示。

图5：肿瘤生长和病毒复制动力学的双生物发光成像研究

图A：显示了通过Rluc成像的MDA-MB-231-Rluc侧腹肿瘤的生长情况。图B：展示了经过病毒溶瘤治疗(1×108 pfu)的MDA-MB-231-Rluc肿瘤的生长抑制情况，同样通过Rluc成像。图C：显示了对照组和病毒处理组的Rluc信号强度，Rluc信号以平均净强度/面积 ± SD表示，星号表示P<0.004。图D：显示了通过卡尺测量的对照组和病毒处理组的肿瘤体积，肿瘤体积以平均值 ± SD表示，星号表示P<0.002。图E：展示了通过Fluc成像的病毒复制的顺序成像。图F：显示了Fluc信号强度随时间的变化，Fluc信号以平均净强度/面积 ± SD表示，箭头表示信号强度多次达到峰值后逐渐下降。

图6：微PET成像下的病毒复制与细胞增殖动态：[18F]FHBG-PET与[18F]FLT-PET的应用

研究中，病毒被注射到双侧腹股沟肿瘤的左侧。通过[18F]FHBG-PET成像，发现[18F]FHBG在病毒感染的肿瘤中被摄取，而在对照肿瘤中则没有摄取。动态PET扫描后的时间-活性曲线显示，[18F]FHBG在病毒感染的肿瘤中积累，而在心脏、肝脏和对照肿瘤中则被清除。此外，通过[18F]FLT-PET成像识别出增殖的肿瘤，光子缺乏区域标识了肿瘤核心中的病毒复制位点。

图7：体外生物发光、荧光和微PET成像数据的相关性

A部分：显示了病毒注射前肿瘤的特征，通过Rluc生物发光、mCherry荧光和[18F]FLT-PET(小箭头)识别肿瘤。H&E和PCNA显示体外高度增殖的肿瘤。

B部分：显示了溶裂病毒复制后肿瘤特征的变化，48小时后通过Rluc、mCherry和[18F]FLT-PET(箭头)识别出破坏的肿瘤核心，H&E和PCNA显示破坏的肿瘤核心(箭头)被存活的肿瘤边缘(星号)包围。

C部分：通过Fluc生物发光和[18F]FHBG-PET识别出复制的病毒。IHC染色用于LacZ和HSV-TK(切除肿瘤中的箭头)确认病毒的存在，破坏的肿瘤核心中观察到凋亡。

研究结论

本研究通过生物发光和PET成像技术成功检测了稳定表达mCherry和Rluc的细胞系以及复制条件HSV-1突变体HSV-Luc。体外实验中，Fluc生物发光信号与病毒滴度相关，高滴度(1×108 pfu)感染后18小时和30小时出现两个峰值，对应病毒复制周期。低滴度(1×103至1×105 pfu)则无法检测到，细胞计数随时间增加。体内实验中，通过生物发光和PET成像研究了HSV-1在携带肿瘤异种移植物的小鼠中的复制动力学，发现Fluc信号随时间出现峰值，与病毒释放后的复制周期相符。通过双重Fluc和Rluc生物发光成像研究了HSV-Luc感染肿瘤后的病毒复制和肿瘤反应，发现病毒处理组Rluc表达区域随时间减少，Fluc信号在病毒注射后6小时达到峰值，随后每2天出现一次峰值，表明新释放的病毒颗粒。这些结果表明，生物发光和PET成像技术可以有效监测病毒溶瘤治疗的效果。