CXCR4抑制可调节肿瘤微环境并延缓B16-OVA黑色素瘤和Renca肿瘤的生长性喘

同源异体小鼠肿瘤模型是免疫肿瘤学(I/O)研究中不可或缺的临床前模型，但它们对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应有限，这可能是由于它们的固有低免疫原性。为了解决这一问题，研究人员通过将鸡卵清蛋白(OVA)这一高度免疫原性的蛋白质表达到同源异体肿瘤细胞中，开发了新的免疫原性同源异体模型。这些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，显示出比它们的亲本细胞系更慢的肿瘤生长速度，这可能是由于免疫介导的排斥反应。更重要的是，这些OVA表达的模型对ICIs，特别是抗PD-1治疗，表现出更高的敏感性，这表明它们在增强T细胞介导的免疫反应方面具有潜力。此外，通过过继T细胞转移实验，研究人员验证了这些模型中存在肿瘤特异性记忆T细胞。这些结果表明，OVA工具细胞不仅增强了对ICIs的反应，而且为临床前免疫治疗评估提供了新的、具有更高免疫原性的同源异体模型，这对于I/O研究具有重要的意义。

基本信息

英文标题：CXCR4 inhibition modulates the tumor microenvironment and retards the growth of B16-OVA melanoma and Renca tumors

中文标题：CXCR4抑制可调节肿瘤微环境并延缓B16-OVA黑色素瘤和Renca肿瘤的生长

发表期刊：《Front Endocrinol》

影响因子：3.9

作者单位：

1.Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

2.Department of Spine Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

3.Key Laboratory of Liver Disease of Guangdong Province, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

作者信息：Yuzhen Zhang, Yutian Chong, Liang Peng, Fangji Yang, Wenxiong Xu, Lina Wu, Luo Yang, Shu Zhu, Lu Wang, Wenbin Wu

研究背景

黑色素瘤是一种潜在的侵袭性、致命的癌症，近年来虽有多种新的治疗方式出现，如针对BRAFV600E突变和MEK的靶向治疗以及免疫检查点抑制剂等，但大多数患者仅能获得部分缓解，仍需额外或替代的治疗方法。CXCR4是一种G蛋白偶联受体家族成员，表达于多种细胞类型，包括T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和内皮细胞等。它在与配体CXCL12结合后会触发多条下游信号传导通路，从而影响细胞增殖、迁移、存活等过程。研究表明，CXCR4在多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤中过表达，且在黑色素瘤中其表达水平与疾病死亡风险相关，是独立的预后因素。CXCR4在癌细胞生存和转移中起关键作用，可能通过激活促生存信号使癌细胞对免疫攻击产生抵抗。此外，CXCR4对于癌细胞向表达CXCL12的器官转移至关重要，它使肿瘤细胞能够进入支持其生存和生长的细胞微环境，如骨髓、肝脏、肺和淋巴结等。

研究方法

本研究使用了B16黑色素瘤细胞(H2b)和Renca肾癌细胞系进行实验。B16-OVA细胞由Dr. Ben Izar提供，Renca DM细胞由Dr. Gordon Freeman提供。细胞在含有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和50 pg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基中培养。实验使用了6-8周龄的C57BL/6和Balb/c雌性小鼠，分别皮下接种B16-OVA或Renca DM细胞。在肿瘤达到一定直径后开始治疗，分为多个组，分别给予不同药物处理，包括X4-136、抗PD-L1、抗PD-1、阿西替尼等，以及它们的联合用药。治疗期间肿瘤体积通过公式V=(最小直径)×最大直径/2计算。实验结束后，肿瘤组织被切除用于Western blot分析、实时定量PCR和流式细胞术检测。RNA提取使用Purelink RNA Minikit，cDNA制备使用Reverse Transcriptase Mix，实时定量PCR使用Taqman探针。Western blot检测了p-Akt、Akt、p-FOXO-3a、FOXO-3a、cyclin D1、IDO1和B-Actin等蛋白。流式细胞术检测了CD3、CD8a、穿孔素、Gr-1、CD11b、FOXP3、CD25、CD4等免疫细胞标志物，以及H-2Kb/SINFEKL四聚体用于检测OVA特异性CD8 T细胞。统计分析使用Graph Pad Prism软件，通过单因素方差分析和学生t检验计算组间差异，p值<0.05被认为具有统计学意义。

实验结果

图1：X4-136及免疫检查点抑制剂抗体对同系B16-OVA黑色素瘤生长的影响

小鼠分别单独或联合接受X4-136、抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4+抗PD-L1治疗，如图所示。肿瘤生长以均值±标准误(n=5-6)绘制。

图2：X4-136和免疫检查点抑制剂抗体对肿瘤微环境中细胞浸润的影响

经过16天的治疗后，收获并消化黑色素瘤组织。通过流式细胞术分析单细胞悬浮液，检测以下免疫细胞群体：(a)CD3+细胞，(b)CD8+细胞，(c)CD8+穿孔素+淋巴细胞，(d)OVA特异性CD8+淋巴细胞，即结合PE标记的H-2Kb/SINFEKL四聚体的CD8+淋巴细胞，(e)髓系来源的抑制细胞(MDSC)，和(f)调节性T细胞(Tregs)。结果显示为相对于对照组的细胞数量变化倍数，并以均值±标准误(n=5-6)表示。

图3：X4-136单独或联合免疫检查点抑制剂对免疫相关基因表达的影响

X4-136单独或与免疫检查点抑制剂联合使用可抑制CTLA-4、IDO-1和Foxp3 mRNA的表达，并增加颗粒酶B的表达。从肿瘤组织中提取总RNA，并使用特异性探针分析(a)CTLA-4，(b)颗粒酶B，(c)Foxp3和(d)IDO-1的表达。结果显示为相对于对照组的特定mRNA水平变化倍数，并以均值±标准误(n=3)表示。(e)从分离的黑色素瘤中制备全细胞裂解物，并通过Western blot使用特异性抗体分析IDO-1的表达，以β-actin作为加载对照。

图4：X4-136与免疫检查点抑制剂对Akt/FOXO-3a通路的影响

X4-136单独或与免疫检查点抑制剂联合使用对Akt/FOXO-3a通路的影响。从分离的黑色素瘤或处理过的细胞中制备全细胞裂解物，并使用特异性抗体检测各种蛋白的表达，以β-actin作为加载对照。

图5：X4-136与阿西替尼在Renca-D肾癌模型中的效果

在Renca-D肾癌模型中，小鼠分别接受X4-136、阿西替尼单独或联合治疗。肿瘤生长以均值±标准误(n=5-6)绘制。治疗8天后，收获肿瘤并制备单细胞悬浮液，通过流式细胞术分析(b)CD3+细胞，(c)CD8+细胞，(d)CD8+穿孔素+淋巴细胞，(e)髓系来源的抑制细胞(MDSC)，和(f)调节性T细胞(Tregs)。结果显示为相对于对照组的细胞数量变化倍数，并以均值±标准误(n=5-6)表示。

研究结论

本研究发现，CXCR4抑制剂X4-136单独使用或与免疫检查点抑制剂联合使用，均能显著抑制B16-OVA黑色素瘤的生长。X4-136单独使用时，肿瘤生长抑制效果优于单独使用抗PD-1或抗PD-L1抗体。与抗PD-L1抗体联合使用时，可产生协同抗肿瘤效果，但与抗PD-1或抗CTLA-4+抗PD-L1联合使用时未观察到协同效果。X4-136单独使用或与免疫检查点抑制剂联合使用，均能显著增加肿瘤微环境中CD3+细胞和CD8+细胞的浸润，尤其是激活的CD8+穿孔素+淋巴细胞的数量显著增加，这表明CXCR4抑制增强了T细胞的活性。此外，X4-136还能减少肿瘤微环境中的免疫抑制细胞群体，如髓系来源的抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞(Tregs)。在黑色素瘤模型中，CXCR4抑制还导致CTLA-4、IDO-1和Foxp3 mRNA水平的降低，以及颗粒酶B表达的增加。在Renca-DM肾癌模型中，X4-136单独使用或与抗VEGFR药物阿西替尼联合使用，均能显著抑制肿瘤生长，且联合使用时效果更佳。这些结果表明，CXCR4抑制剂X4-136具有显著的抗肿瘤活性，且与免疫检查点抑制剂联合使用时可进一步增强其效果。