NTCP细胞助力乙肝疾病研究丨NTCP缺乏影响循环胆汁酸水平并诱导骨质疏松症影响

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：NTCP Deficiency Affects theLevels of Circulating Bile Acidsand Induces Osteoporosis

中文标题：NTCP缺乏影响循环胆汁酸水平并诱导骨质疏松症

发表期刊：《Front Endocrinol》

影响因子：3.9

作者单位

1.Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

2.Department of Spine Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

3.Key Laboratory of Liver Disease of Guangdong Province, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

作者信息

Yuzhen Zhang, Yutian Chong, Liang Peng, Fangji Yang, Wenxiong Xu, Lina Wu, Luo Yang, Shu Zhu, Lu Wang, Wenbin Wu

研究背景

NTCP由SLC10A1基因编码，是胆汁酸转运蛋白及乙肝病毒和丁肝病毒的细胞受体。它在胆汁酸的肠肝循环中起关键作用，其缺乏会导致血液中胆汁酸水平升高。2015年首次报道了因基因突变导致的NTCP缺乏症，此后发现该病症常表现为高胆汁酸血症，但具体表型特征和长期预后尚不明确。本研究旨在描述NTCP缺乏的表型特征、胆汁酸谱变化，并评估其长期预后。

研究方法

本研究纳入了10名p.Ser267Phe SLC10A1突变的纯合子个体、20名杂合子个体及20名健康野生型志愿者，所有参与者均签署知情同意书，项目获伦理委员会批准。此外，还生成了NTCP敲除小鼠模型，小鼠在标准条件下饲养，部分雌性小鼠进行了卵巢切除术，动物使用获相关委员会批准。研究分析了受试者的临床参数，包括血清中总胆汁酸水平、肝功能、血脂和维生素水平，以及小鼠血清中的骨保护素和核因子κB配体受体激活剂水平。利用UPLC-MS/MS系统对人类和小鼠血清样本中的胆汁酸进行高通量谱分析和定量。通过微CT成像和组织学分析评估小鼠骨骼状况。数据以均值±标准差或中位数及四分位数表示，组间差异通过Kruskal-Wallis检验、学生t检验或方差分析进行分析，p值<0.05被认为具有统计学意义，图表使用GraphPad Prism 6.0或R编程语言生成。

实验结果

图1：两名纯合子个体的腰椎和股骨颈的DXA扫描结果

38岁的男性纯合子个体(A-D)，腰椎(L1-L4)和股骨颈的Z分数分别为-3.0和-1.9，DXA诊断为骨量减少。在随访中，腰椎和股骨颈的Z分数分别降至-3.3和-2.2。47岁的女性纯合子个体(E-H)，腰椎(L1-L4)和股骨颈的T分数分别为-2.6和-1.7，DXA诊断也为骨量减少。在随访中，腰椎和股骨颈的T分数分别降至-3.1和-2.4。

图2：p.Ser267Phe突变纯合子个体血清中胆汁酸谱的显著改变

A) 血清中总胆汁酸水平。

B) 使用所有鉴定的胆汁酸对野生型(WT)、杂合子(HET)和纯合子(HOM)个体进行主成分分析(PCA)。

C) 血清中25(OH)D3水平。

D) 总初级和次级胆汁酸的比例，以及初级与次级胆汁酸比值的箱线图。

E) 总结合型和未结合型胆汁酸的比例，以及结合型与未结合型胆汁酸比值的箱线图。

F) 初级和次级胆汁酸。

G) 血清中未结合型、甘氨结合型和牛磺结合型胆汁酸的浓度。*表示p < 0.05，**表示p < 0.001，***表示p < 0.0001。

图3：NTCP缺乏对卵巢切除(Ovx)小鼠骨质疏松症的影响

A) 在建立Ovx或假手术(SHAM)模型后8周内，野生型假手术(WT SHAM)、NTCP敲除假手术(KO SHAM)、野生型卵巢切除(WT Ovx)和NTCP敲除卵巢切除(KO Ovx)小鼠的体重变化。B) 和 C) 代表性微计算机断层扫描(micro-CT)图像，显示WT SHAM、KO SHAM、WT Ovx和KO Ovx小鼠股骨的垂直(B)和横截面(C)。D) NTCP缺乏加剧了Ovx小鼠的骨质疏松症。指标包括骨体积/组织体积(Bv/Tv)、骨表面积/骨体积(Bs/Bv)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁数量(Tb.N)、小梁间距(Tb.Sp)和小梁模式因子(Tb.Pf)，皮质壁厚度(CWT)。每组6只小鼠。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。

图4：NTCP缺乏对卵巢切除(Ovx)小鼠成骨和破骨的影响

(A-C)代表性苏木精-伊红(H&E)染色(A)和抗酸性磷酸酶(TRAP)染色(B)的股骨组织切片，来自野生型假手术(WT SHAM)、NTCP敲除假手术(KO SHAM)、野生型卵巢切除(WT Ovx)和NTCP敲除卵巢切除(KO Ovx)小鼠。计算了各组中TRAP阳性细胞的比例(C)。(D-F)野生型假手术(WT SHAM)、NTCP敲除假手术(KO SHAM)、野生型卵巢切除(WT Ovx)和NTCP敲除卵巢切除(KO Ovx)小鼠的RANKL和OPG水平，以及RANKL与OPG的比值。每组6只小鼠。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001，****表示p < 0.0001。

图5：NTCP缺乏对小鼠血清中胆汁酸(BAs)水平的影响

(A-D)野生型假手术(WT SHAM)、NTCP敲除假手术(KO SHAM)、野生型卵巢切除(WT Ovx)和NTCP敲除卵巢切除(KO Ovx)小鼠血清中ALT、AST、TBA和25(OH)D3的水平，每组6只小鼠。(E)总初级和次级胆汁酸的比例，以及初级与次级胆汁酸比值的箱线图。(F)总结合型和未结合型胆汁酸的比例，以及结合型与未结合型胆汁酸比值的箱线图。(G)初级和次级胆汁酸。(H)血清中未结合型、甘氨结合型和牛磺结合型胆汁酸的浓度。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。

研究结论

本研究对10名携带NTCP p.Ser267Phe纯合突变的个体进行了5年随访，发现这些个体存在高胆汁酸血症、维生素D缺乏、骨量减少和胆囊异常，但未出现明显临床症状。进一步分析显示，纯合子个体血清中总胆汁酸浓度显著增加，初级和结合型胆汁酸比例升高，25(OH)D3水平降低。此外，NTCP敲除小鼠模型显示，NTCP缺乏加剧了卵巢切除诱导的骨质疏松，表现为骨量减少和骨吸收增加，且小鼠血清中胆汁酸水平升高，维生素D水平降低，与人类纯合子个体的结果一致。