Nanoluc细胞文献推荐:小鼠大脑皮层缺氧区域的氧气成像

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。

NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Oxygen imaging of hypoxic pockets in the mouse cerebral cortex

中文标题：小鼠大脑皮层缺氧区域的氧气成像

发表期刊：《SCIENCE》

影响因子：44.7

作者单位

1.Division of Glial Disease and Therapeutics, Center for Translational Neuromedicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2200 Copenhagen, Denmark.

2.School of Engineering, FHNW University of Applied Sciences and Arts Northwestern Switzerland, 5210 Windisch, Switzerland.

3.Division of Glial Disease and Therapeutics, Center for Translational Neuromedicine, University of Rochester Medical Center, Rochester, NY 14642, USA.

作者信息：Felix R. M. Beinlich, Antonios Asiminas, Verena Untiet, Zuzanna Bojarowska, Virginia Plá, Björn Sigurdsson, Vincenzo Timmel, Lukas Gehrig, Michael H. Graber, Hajime Hirase, Maiken Nedergaard.

研究背景

意识在脑血流停止后几秒内丧失，大脑无法储存氧气，氧化磷酸化的中断几分钟内致命。大脑的高代谢率和氧气消耗使其特别容易受到氧化应激的影响，这种应激在多种神经系统疾病的发展中起着关键作用。然而，目前对于生理条件下大脑皮层局部氧分压(Poz)动态变化的了解还非常有限，主要由于缺乏空间精确的Poz成像测量技术。

研究方法

研究者们通过在野生型小鼠的大脑皮层星形胶质细胞中表达Green enhanced Nano-lantern (GeNL)，并局部给予底物furimazine，测量生物发光强度(BLI)，以评估GeNL在检测局部氧分压(PO2)动态变化中的应用。实验中，通过逐步改变呼吸空气中的氧气浓度，并使用O2敏感的Clark型微电极校准BLI，记录绝对PO2值。此外，研究者们还排除了pH变化对BLI的影响，通过在表达pH传感器的小鼠中进行实验。在清醒活动的小鼠中，通过空气喷射刺激胡须，测试BLI是否能检测到感觉诱导的皮层PO2变化。连续成像BLI揭示了休息条件下局部短暂的PO2下降事件，称为“缺氧区域”，并记录了这些区域的数量、面积、持续时间和幅度。研究还评估了血管扩张(通过高碳酸血症和异氟醚麻醉)和毛细血管停滞(通过注射微球)对缺氧区域的影响。最后，通过训练小鼠耐受头部固定，比较了清醒静止和运动小鼠的缺氧区域变化，发现运动显著减少了缺氧区域的负担。这些实验方法综合评估了GeNL在检测小鼠大脑皮层局部氧分压动态变化中的应用，特别是在清醒活动和运动条件下的变化。

实验结果

图1：Green enhanced Nano-lantern(GeNL)的生物发光强度(BLI)如何报告大脑局部氧分压(PO2)

实验中，KX麻醉的小鼠在胶质纤维酸性蛋白启动子下表达GeNL，被放置在宏观镜下，并暴露于不同浓度的氧气中。一个O2敏感的微电极通过急性开颅手术插入皮层，并补充含furimazine(0.25 mM)的人工脑脊液。在O2存在下，furimazine在GeNL的催化下转化为furimamide，产生生物发光。BLI和mNeonGreen荧光的叠加图像显示了开颅和氧敏感微电极的位置。BLI随吸入氧气浓度的变化而变化，单帧图像(1秒曝光时间)在不同氧气浓度下显示了BLI的变化。BLI和PO2的平均变化轨迹显示了在不同氧气浓度下BLI和PO2的变化，阴影区域表示标准误差。当吸入氧气浓度翻倍时，BLI强度变化162%(±19.13，SEM)，10%的氧气增加导致BLI增加66%(±6.70)，而在缺氧条件下，BLI减少了29%(±2.91)。相应地，当氧气浓度翻倍时，PO2增加了52.4 mmHg(±2.4)，10%的氧气增加使PO2增加了18.6 mmHg(±1.9)，10%的减少使PO2减少了9.7 mmHg(±1.6)。通过方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验，不同氧气浓度下的BLI和PO2变化具有显著性差异。BLI的变化与O2电极记录的PO2变化呈线性关系，决定系数R2为0.82。在清醒、静止、头部固定的小鼠中，通过BLI测量了体感皮层的PO2，并在胡须刺激下观察了PO2的变化。在每次10次重复的胡须刺激期间，PO2均升高，均值±SEM被展示出来，***P < 0.001，****P < 0.0001。[(D)至(F)]来自六只小鼠的9次试验。a.u.，任意单位。比例尺，100毫米。

图2：研究者们通过生物发光强度(BLI)成像技术，对KX麻醉小鼠的大脑体感皮层进行了20分钟的局部氧分压(PO2)成像

结果显示，大脑皮层中存在局部短暂的PO2下降事件，称为“缺氧区域”。这些缺氧区域在空间上受限，持续时间从几秒到几分钟不等，通常表现出相对组织PO2的锐利起始和结束。研究者们通过手动绘制圆形区域(ROI)来识别这些缺氧区域，并记录了它们的数量、面积、持续时间和幅度。在20分钟的记录中，每只小鼠平均检测到200±22个缺氧区域，每个ROI每分钟平均发生0.15±0.01次缺氧区域，意味着大约每7分钟在同一位置发生一次。缺氧区域的平均直径为45.29±0.31微米，形状接近圆形。这些缺氧区域的特征包括负幅度、锐利的起始和结束、清晰的边缘和长持续时间。研究还发现，缺氧区域的PO2变化与低氧阈值(≤18 mmHg)相似，表明这些区域确实达到了缺氧状态。此外，缺氧区域的分布和特征在不同小鼠之间表现出一定的变异性，但总体上显示出一致的模式。这些结果为理解大脑皮层在生理条件下的氧动态提供了重要见解。

图3：血管扩张和毛细血管停滞对麻醉小鼠大脑皮层缺氧区域的影响

实验中，KX麻醉小鼠在急性开颅后暴露于10% CO2的吸入空气中10分钟，测量大脑局部氧分压(PO2)。结果显示，高碳酸血症期间，缺氧区域的数量和覆盖面积显著减少，而PO2显著增加。具体来说，高碳酸血症期间，每平方毫米的缺氧区域数量从3.9±0.1减少到2.3±0.1，覆盖面积从1.01%减少到0.47%。此外，缺氧区域的持续时间和幅度也有所减少。进一步实验中，通过向小鼠体内注射4微米的微球诱导毛细血管停滞，同时使用混合BLI-荧光显微镜同时成像BLI和微球荧光。结果显示，微球注射后，缺氧区域的数量减少，但覆盖面积增加，表明缺氧区域可能融合在一起。微球引起的缺氧区域持续时间缩短，但幅度和大小显著增加。这些结果表明，血管扩张通过增加组织PO2减少缺氧区域，而毛细血管停滞则直接引发缺氧区域的形成，为理解大脑皮层氧动态提供了重要见解。

图4：研究了不同觉醒水平对小鼠大脑皮层缺氧区域的影响

实验中，分别在KX麻醉小鼠、清醒固定头部的小鼠(处于安静觉醒状态)以及在聚苯乙烯球上自愿运动的小鼠中测量大脑局部氧分压(PO2)。结果显示，与KX麻醉小鼠相比，清醒静止小鼠的缺氧区域数量减少了17%，而运动小鼠的缺氧区域数量进一步减少了35%。此外，运动小鼠的缺氧区域覆盖面积比静止小鼠减少了33%，持续时间缩短了7秒，幅度也有所降低。这些结果表明，觉醒水平的提高，尤其是运动，显著减少了大脑皮层的缺氧区域负担。具体来说，运动小鼠的缺氧区域负担比安静觉醒小鼠减少了52%。这些发现表明，运动通过增加脑血流和组织氧分压，显著减少了大脑皮层的缺氧区域，为理解大脑氧动态提供了重要见解。