Jagged1-Fluc：一种用于结直肠癌高通量筛选的发光重组蛋白敏感工具

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Jagged1-Fluc: A Luminescent Recombinant Protein as a Sensitive Tool for High-Throughput Screening of Colorectal Cancer

中文标题：Jagged1-Fluc：一种用于结直肠癌高通量筛选的发光重组蛋白敏感工具

发表期刊：《BioFactors》

影响因子：5

作者单位：

1.Department of Biological and Environmental Sciences, Alma Mater Studiorum, University of Bologna, Bologna, Italy

2.Interuniversity Consortium for the Study of Biological Structures and Biosystems (INBB), Rome, Italy

3.University of Trieste, Trieste, Italy

4.Gastroenterology Unit, IRCCS Azienda Ospedaliero-Universitaria di Bologna, Bologna, Italy

作者信息：

第一作者：Angela Punzo

通讯作者：Cristiana Caliceti

研究背景

结直肠癌(CRC)是全球第三大常见癌症，其发生发展与Notch信号通路失调密切相关。Notch受体(如Notch1、Notch3)及其配体Jagged1(Jag1)在侵袭性CRC亚型中过表达，但现有检测方法(IHC、Western blot等)存在半定量、主观性强、无法绝对定量等局限。为满足临床对Notch表达水平定量评估的需求，本研究开发了一种发光重组探针Jag1-Fluc，将高亲和力突变的Jag1胞外域(ECD)与红色萤火虫荧光素酶(Fluc)融合，通过检测发光强度反映样本中Notch受体的含量，旨在实现结直肠癌早期筛查和病变分级。

研究方法

构建编码JAG1高亲和力突变体(含S32L、R68G、D72N、T87R)的ECD与红色萤火虫荧光素酶(Fluc)的融合基因，插入pFastBac载体，在昆虫细胞(High Five)中表达，经Ni-NTA亲和纯化获得Jag1-Fluc蛋白。检测其发光光谱(580-800 nm)和细胞自由体系中的灵敏度(LOD/LOQ)。在Caco-2细胞(表达Notch3)中，分别用活细胞和固定细胞测试不同浓度(5-50 μg/mL)和孵育时间(1 h vs 过夜)下的发光信号。用可溶性人Jag1-IgG1 Fc嵌合蛋白进行竞争实验，验证探针对Notch受体的特异性。最后，对10例人结肠活检标本(4例增生性息肉，3例低级别腺瘤，3例高级别腺瘤)进行离体发光成像，比较不同病变程度的发光强度。

实验结果

图 1：Jag1-Fluc在细胞自由体系中的发光特性

Jag1-Fluc的发射光谱峰值约610 nm(图1A)，为红色发光。在0-10 μg/mL范围内，发光信号与蛋白浓度呈良好线性(R²=0.99)，检测限(LOD)为0.20±0.03 μg/mL，定量限(LOQ)为0.50±0.03 μg/mL(图1B)，表明探针具有高灵敏度。

图 2：Jag1-Fluc在Caco-2细胞中与Notch受体的结合

在活Caco-2细胞中，Jag1-Fluc(5-50 μg/mL，孵育1 h)产生剂量依赖性发光信号，LOD=0.4±0.2 μg/mL(图2A)。固定细胞中，过夜孵育比1 h孵育信号更强，线性范围相同(图2B)，后续选用过夜孵育(LOD=0.8±0.2 μg/mL)。证明探针能有效结合细胞表面的Notch受体。

图 3：竞争实验验证Jag1-Fluc的特异性

在固定Caco-2和MCF-7细胞中，预先用可溶性人Jag1-Fc嵌合蛋白(0.1-25 μg/mL)过夜孵育，然后加入Jag1-Fluc(50 μg/mL)。随着竞争剂浓度升高，发光信号逐渐降低，IC50在Caco-2中为0.55±0.06 μg/mL(图3A)，在MCF-7中为0.45±0.04 μg/mL(图3B)。证实Jag1-Fluc与Notch受体的结合可被野生型Jag1特异性竞争，无脱靶效应。

图 4：发光成像显示Jag1-Fluc在Caco-2细胞中的结合定位

固定Caco-2细胞与不同浓度Jag1-Fluc(50-400 μg/mL)过夜孵育，发光成像显示信号随浓度增加而增强(图4)。细胞核Hoechst染色与发光信号重叠图显示信号主要分布在细胞膜/胞质区域，不与核重叠(图S7)，符合Notch受体膜定位特征。

图 5：人活检组织中Jag1-Fluc的离体发光成像

对10例人结肠组织(增生性息肉、低级别腺瘤、高级别腺瘤)进行离体发光成像。用Jag1-Fluc(50 μg/mL)孵育过夜后，IVIS成像显示所有样本均有发光，阴性对照(PBS)无信号(图5A-C)。定量分析显示，从增生性息肉→低级别腺瘤→高级别腺瘤，总光通量(p/s)依次升高，高级别腺瘤与增生性息肉之间差异显著(p<0.05)(图5D)。IHC验证Notch3表达与发光信号趋势一致(图S8)。表明该探针可区分不同阶段的结肠病变。

研究结论

本研究开发了一种基于高亲和力Jagged1突变体与红色萤火虫荧光素酶融合的发光探针Jag1-Fluc。该探针在细胞自由体系中灵敏度高(LOD 0.2 μg/mL)，在表达Notch受体的Caco-2细胞中呈剂量依赖性发光，且结合可被可溶性Jag1竞争，证实其特异性。在人结肠活检组织中，Jag1-Fluc的发光强度随病变恶性程度增加(增生性息肉→低级别腺瘤→高级别腺瘤)而递增，与Notch3表达趋势一致，首次实现了对结直肠癌前病变中Notch配体-受体相互作用的定量评估。该方法简便、快速、成本低，有望成为结直肠癌早期筛查和风险分层的新型工具，并为基于Notch信号通路的精准医疗提供可量化的检测手段。