仿生气管支架局部递送紫杉醇与塞来昔布用于增强恶性气管狭窄的化学-免疫治疗

基本信息

英文标题：Local delivery of paclitaxel and celecoxib by bionic tracheal stent to enhance chemo-immunotherapy for malignant tracheal stenosis

中文标题：仿生气管支架局部递送紫杉醇与塞来昔布用于增强恶性气管狭窄的化学 - 免疫治疗

发表期刊：《Chemical Engineering Journal 》

影响因子：13.2

作者单位：

上海交通大学药学院

华东理工大学材料科学与工程学院

上海交通大学分析测试中心(中国上海)

作者信息：

Zhaozhong Wang a , Wang Yin b , Alice Shen Yi Shan a , Jingwen Hou c , Zhu Jin a,* , Shengrong Guo

研究背景

1.临床问题

恶性气管狭窄会造成气道梗阻，引发严重呼吸困难甚至死亡。临床常用的硅胶、金属支架仅能恢复气管通畅，无抗肿瘤活性;全身化疗联合支架植入后，肿瘤组织内药物富集量不足，无法有效抑制局部肿瘤进展。同时传统支架还易引发移位、黏液堵塞、肉芽组织增生、再狭窄等术后并发症。

2.现有技术局限

目前已报道的载药气管支架多以镍钛合金为基材，仅针对良性气管狭窄的组织增生，尚无专门用于恶性气管肿瘤的商业化药物洗脱气管支架;且硅胶、镍钛合金化学性质稳定，难以通过化学改性优化功能。

3.研究切入点与创新点

*选用紫杉醇 (PTX)+** 塞来昔布 (CXB)** 联用：紫杉醇为一线化疗药，可诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(ICD)，但会上调肿瘤细胞 COX-2，促进前列腺素 E₂(PGE₂)分泌，形成免疫抑制微环境;塞来昔布作为 COX-2 选择性抑制剂，可阻断 COX-2/PGE₂信号通路，逆转免疫抑制，二者联用具备协同抗肿瘤潜力。

*构建PCL/EVA 共混高分子双层仿生支架：结合聚己内酯(PCL)优异的生物相容性、可 3D 打印特性与乙烯 - 醋酸乙烯酯共聚物(EVA)高弹性、柔韧性的优势，解决纯 PCL 力学性能与气管软组织不匹配的问题;利用支架实现药物局部缓释，降低全身化疗毒副作用。

*采用 C 形仿生结构：模拟人体气管软骨形态，可形变适配植入操作，同时减少黏液堵塞，兼顾机械支撑与药物治疗双重作用。

研究方法

1. 细胞实验

培养 LLC 肺癌细胞、树突状细胞、巨噬细胞;检测药物作用后肿瘤细胞凋亡、DAMPs 释放;通过细胞共培养，分析免疫细胞表型及细胞因子分泌。

2. 支架制备与材料表征

熔融共混制备 PCL/EVA 复合材料，采用 3D 打印制备双层 C 形仿生载药支架;利用 SEM、DSC、DMA 表征材料微观结构与热 / 力学性能;通过压缩、弯曲、形变恢复实验评价支架力学特性，并验证材料生物相容性。

3. 体外释药与透黏膜实验

采用 HPLC 检测支架中 PTX、CXB 的体外缓释行为;利用离体猪气管组织，评价药物跨黏膜渗透能力。

4. 动物实验

*小鼠皮下肿瘤模型：分为空白对照、静脉紫杉醇、单药支架、双联载药支架组，监测肿瘤生长、生存期与体重;结合染色、流式、转录组分析抗肿瘤效果与免疫机制。

*兔恶性气管狭窄模型：植入支架后借助 CT、内镜评估气道扩张效果与支架稳定性;检测瘤内药物浓度、肿瘤抑制作用。

*安全性评价：检测实验动物血常规、肝肾功能，结合主要脏器与气管组织病理染色，评估全身及局部毒性。

5. 统计学分析

使用 GraphPad Prism 8.0 分析数据，两组比较采用 t 检验，多组比较采用单因素方差分析。

实验结果

图 1 负载紫杉醇 / 塞来昔布的仿生支架制备及其用于恶性气管狭窄局部增强化学 - 免疫治疗的作用机制示意图

制备 PCL/EVA 双层载药支架并植入病变气管;PTX 诱导肿瘤细胞死亡并释放 DAMPs，同时上调 COX-2、促进 PGE₂分泌，造成免疫抑制;CXB 阻断 COX-2/PGE₂通路，促进树突状细胞、巨噬细胞活化，增强 T 细胞抗肿瘤功能，实现协同治疗。

图 2 紫杉醇化疗会上调肺癌细胞中 COX-2 的表达

(A)A) 火山图：经紫杉醇处理后，NCI-H446 细胞的差异表达基因分析(样本数 n≥10)。 (B) 箱线图：正常 NCI-H446 细胞与紫杉醇处理后细胞中PTGS2(COX-2 编码基因)的表达水平(样本数 n≥10)。 (C) 蛋白质免疫印迹：不同浓度紫杉醇(0、40、80、120 nM)处理 24 h 后，LLC 细胞内 COX-2 蛋白的表达情况。 (D) 不同药物处理组 LLC 细胞中 COX-2 基因的表达水平(n=3)。 (E) 不同药物处理 24 h 后，LLC 细胞上清液中 PGE₂的分泌量(n=4)。 (F) 紫杉醇、塞来昔布单药及联合用药处理 24 h 后，LLC 细胞的细胞活力检测结果(n=4)。 (G) 流式细胞术定量检测不同药物处理组 LLC 细胞的凋亡比例(n=3)。 (H) 荧光显微镜下 LLC 细胞活 / 死染色典型图像(绿色代表活细胞，红色代表死细胞;比例尺：200 μm)。 (I) 流式细胞术分析不同药物处理 24 h 后，LLC 细胞的细胞周期分布(n=3)。

小结：PTX 浓度依赖性上调 COX-2 与 PGE₂，CXB 可抑制 PGE₂生成;两药联用协同杀伤肿瘤细胞、阻滞细胞周期。

图 3 体外及体内实验中损伤相关分子模式释放与抗肿瘤免疫应答

(A、B) 免疫荧光染色及定量分析：不同处理组 LLC 细胞表面钙网蛋白(CRT)外翻情况(比例尺：20 μm，n=3)。 (C) 不同处理组 LLC 细胞胞外三磷酸腺苷(ATP)的释放量(n=3)。 (D) 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同处理组 LLC 细胞胞外高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)的释放量(n=4)。 (E、F) 流式细胞术及定量分析：与药物处理后肿瘤细胞共培养的 RAW264.7 巨噬细胞表型，以及 M1 型巨噬细胞占比(n=3)。 (G、H) 流式细胞术及定量分析：树突状细胞成熟表型(CD80⁺CD86⁺)及成熟树突状细胞占比(n=3)。 (I) ELISA 检测 DC2.4 树突状细胞分泌的肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)浓度(n=3)。 (J) ELISA 检测 DC2.4 树突状细胞分泌的白介素 - 12(IL-12)浓度(n=3)。 (K) 小鼠足垫疫苗实验的操作流程示意图。 (L) 流式细胞术分析：接种药物处理后 LLC 细胞，小鼠引流淋巴结中 CD11c⁺树突状细胞表面 CD80、CD86 的表达水平。

小结：PTX 诱导肿瘤细胞释放 DAMPs，联用 CXB 可显著促进免疫细胞活化，提升抗肿瘤免疫应答。

图 4 负载紫杉醇 / 塞来昔布的仿生气管支架制备与表征

A)PCL/EVA 共混材料的制备流程示意图。 (B) PCL/EVA 共混材料(醋酸乙烯酯含量 42%，配比 3:1)冷冻断面的扫描电镜图像(比例尺：5 μm)。 (C) PCL/EVA 共混材料的差示扫描量热(DSC)曲线。 (D) 材料损耗因子(tanδ)随温度变化的曲线。 (E) 不同配比 PCL/EVA 共混材料的拉伸应力 - 应变曲线。 (F、G) 共混材料的断裂伸长率、拉伸强度定量统计结果(n=3)。 (H) PCL/EVA 材料浸提液培养人脐静脉内皮细胞 12 天后的活 / 死细胞荧光染色图像(绿色为活细胞，红色为死细胞;比例尺：100 μm)。 (I) 本研究自主研发的 3D 打印设备实物图。 (J) 药物洗脱支架的整体结构示意图。 (K) 成品仿生药物洗脱支架实物图。 (L) 支架双层结构的扫描电镜图像(比例尺：100 μm)。 (M) 支架缺口水平放置状态下径向压缩实验示意图，以及 37℃环境中压缩力 - 位移变化曲线。 (N) 支架缺口竖直放置状态下径向压缩实验示意图，以及 37℃环境中压缩力 - 位移变化曲线。 (O) 三点弯曲实验示意图，以及 37℃环境中支架弯曲力 - 位移变化曲线。 (P) 不同配方支架在 37℃条件下自膨胀后的形变恢复率(n=3)。 (Q) 高效液相色谱检测载药支架在含 0.5% 十二烷基硫酸钠的 PBS 溶液中，紫杉醇、塞来昔布的体外累计释放曲线(n=3)。 (R) 药物洗脱支架中的药物穿透猪气管上皮的扩散实验示意图。 (S) 猪气管渗透模型中，紫杉醇、塞来昔布的渗透量检测结果(n=3)。 (T) 药物释放前，支架载药涂层表面的扫描电镜图像(比例尺：50 μm)。 (U) 药物释放完成后，支架载药涂层表面的扫描电镜图像(比例尺：50 μm)。

小结：PCL/EVA 材料柔韧性、生物相容性良好;支架力学稳定、自膨性能优异，药物可平稳缓释并有效穿透气管黏膜。

图 5 PTX/CXB 载药支架的体内抗肿瘤效果评价

(A)小鼠皮下肿瘤模型造模、给药及样本分析的实验流程。 (B) 各组小鼠皮下肿瘤的生长变化曲线。 (C、D) 实验终点各组肿瘤实物照片及肿瘤重量统计结果。 (E) 各组小鼠生存时长曲线。 (F) 实验周期内小鼠体重变化曲线。 (G) 肿瘤组织苏木精 - 伊红(H&E)染色切片。 (H、I) 肿瘤组织 TUNEL 凋亡染色图像及凋亡细胞定量分析。 (J、K) 肿瘤组织 Ki67 增殖染色图像及增殖细胞定量分析。 (L、M) 肿瘤组织 CD31 血管内皮染色图像及新生血管定量分析。 (N) 紫杉醇 / 塞来昔布支架组与空白对照组肿瘤组织的差异表达基因统计。 (O) 差异表达基因的 GO 功能富集分析。 (P、Q) 差异表达基因的 KEGG 通路富集分析。 (R、S) 基因集富集分析(GSEA)，分析抗肿瘤免疫相关通路的活化情况。

小结：双联载药支架抑瘤效果最优，可诱导肿瘤凋亡、抑制增殖与血管生成，无明显全身毒性，并激活抗肿瘤免疫相关通路。

图 6 PTX/CXB 载药支架在体内激活肿瘤组织抗肿瘤免疫

(A、B) 肿瘤组织 COX-2 免疫组化染色图像及定量分析结果。 (C) 各组肿瘤组织内 PGE₂含量检测结果。 (D、E) 肿瘤组织钙网蛋白(CRT)免疫荧光染色图像及定量分析。 (F) 肿瘤组织 HMGB1 蛋白表达染色图像。 (G、H) 肿瘤组织内成熟树突状细胞占比统计。 (I、J) 肿瘤组织中多形核髓系来源抑制细胞(PMN-MDSCs)占比统计。 (K、L) 肿瘤组织内巨噬细胞 M1/M2 表型比例统计。 (M、N、O) 肿瘤组织中 CD4⁺、CD8⁺ T 淋巴细胞占比统计。 (P、Q) 肿瘤组织中效应型 CD4⁺IFN-γ⁺ T 细胞比例。 (R、S) 肿瘤组织中细胞毒性 CD8⁺IFN-γ⁺ T 细胞比例。 (T、U) 肿瘤组织中细胞毒性 CD8⁺颗粒酶 B⁺ T 细胞比例。 (V、W) 小鼠引流淋巴结中成熟树突状细胞占比统计。 (X) 肿瘤微环境中促炎细胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-12 的含量检测结果。

小结：联用药物可阻断免疫抑制通路，减少抑制性细胞浸润，全面活化抗肿瘤免疫细胞，重塑肿瘤微环境。

图 7 载药支架对兔恶性气管狭窄的体内治疗效果

(A)基于 CT 扫描、三维建模、个性化 3D 打印气管支架及支架植入的完整实验流程。 (B) 兔恶性气管狭窄模型的气管 CT 扫描图像。 (C) 狭窄气管的三维重建图像。 (D) 支架植入后兔气管的 CT 图像。 (E、F、G) 内镜图像：支架植入前 (E)、植入当日 (F)、植入 14 天后 (G) 的兔气管状态。 (H) 支架在气管内部的放置位置示意图。 (I) 不同处理组兔气管肿瘤实物照片。 (J) 各组气管肿瘤体积统计结果(n=3)。 (K) 肿瘤组织 TUNEL 凋亡染色切片(比例尺：100 μm)。 (L) 肿瘤组织 H&E 染色切片(比例尺：100 μm)。

小结：支架可有效扩张气管、无移位及并发症;局部给药瘤内药物浓度更高，显著抑制气管肿瘤进展。

图 8 PTX/CXB 气管支架的体内安全性评价

(A、B) 空白对照组与支架植入组兔气管组织的 H&E 染色、马松三色染色切片(比例尺：200 μm)。 (C) 两组实验兔的血常规指标(白细胞、红细胞)、肝肾功能指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶)检测结果。 (D) 支架植入组兔心、肝、脾、肺、肾主要脏器的 H&E 染色切片(比例尺：100 μm)。小结：支架植入后局部组织无明显炎症、增生，动物各项生理指标与脏器均无异常，体内安全性良好。

研究结论

研究结论

· 紫杉醇会激活肿瘤 COX-2/PGE₂通路引发免疫抑制，塞来昔布可阻断该通路，两药联用实现化学 - 免疫协同抗肿瘤。

· 成功制备 PCL/EVA 双层 C 形 3D 打印仿生支架，力学性能、柔韧性与生物相容性优良，可实现药物长效局部缓释。

· 该支架可同步完成气管物理扩张与肿瘤靶向治疗，局部给药提升药效、降低全身毒副作用，还可诱导长效抗肿瘤免疫。

· 该一体化多功能支架，为恶性气管狭窄提供了具备临床转化潜力的全新治疗方案。

文献意义

本研究研发出针对恶性气管狭窄的 3D 打印药物洗脱仿生气管支架，阐明了紫杉醇联合塞来昔布的免疫协同作用机制;打破传统支架仅具备物理支撑功能的局限，材料体系与治疗方案实用性强，为气道肿瘤介入治疗开辟了新方向。