膀胱类器官成功移植至去上皮化小鼠结肠：膀胱扩大术的革新方向

研究背景

膀胱扩大术常采用胃肠道段替代受损膀胱，以改善神经源性膀胱功能障碍等患者的膀胱顺应性和容量，但胃肠道上皮长期暴露于尿液中，易引发结石(发生率最高达 40%)和恶性转化(发生率 1%-4.6%)等严重远期并发症，患者需终身监测。现有替代方案如输尿管膀胱成形术适用范围有限，难以广泛推广。类器官技术的发展为组织工程和再生医学提供了新工具，此前已有肠道类器官移植成功案例，但膀胱类器官在结肠部位的移植尚未见报道，亟需开发新型移植技术以规避传统手术的并发症风险。

这篇发表在《Pediatric Surgery International》上题为Successful engraftment of bladder organoids in deepithelialized mouse colon的文章，首次通过上皮置换技术，将膀胱类器官(BO)成功移植到去上皮化的小鼠结肠，实现了具有增殖活性的尿路上皮组织重建，为开发新型膀胱扩大术、降低结石形成和恶性转化风险提供了创新性技术支撑。

实验方法

膀胱类器官培养：取增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠的膀胱组织，剪碎后用胶原酶消化分离尿路上皮细胞;将细胞接种于基质胶中，在 Advanced DMEM/F-12 培养基中培养至少 14 天，获得基底型膀胱类器官，复苏后调整细胞浓度至 1.0×10⁵个 / 20μL 备用。

小鼠结肠去上皮化处理：麻醉 C57BL/6 野生型小鼠，经腹中线切口暴露近端结肠，选取约 1cm 长肠段，两端插入导管并结扎固定;注入 500mM EDTA 溶液孵育 1 分钟，随后用 25-50mL PBS 冲洗肠腔，剥离结肠上皮，保留黏膜下层及肌肉层完整。

膀胱类器官移植：用止血钳夹闭去上皮化肠段两端，将备好的膀胱类器官细胞悬液注入肠段内，孵育 10 分钟;移除导管并缝合肠道切口，逐层关闭腹腔，术后小鼠喂养专用恢复饲料 7 天，随后常规喂养。

样本收集与处理：分别在术后 2、7、28 天处死小鼠(每组 3 只)，获取移植部位肠段;纵向切开后荧光立体显微镜观察 EGFP⁺细胞分布，样本经固定、脱水、包埋后制作 8μm 冷冻切片，用于 HE 染色和免疫荧光分析。

组织学与免疫荧光检测：HE 染色观察组织形态;免疫荧光染色标记 EGFP(移植细胞)、CK5/CK14(尿路上皮标志物)、CA2(结肠上皮标志物)、Ki67(增殖标志物)等，激光共聚焦显微镜成像，定量分析 EGFP⁺细胞层数及 Ki67⁺细胞比例。

关键结果

图1：实验设计与膀胱类器官培养特征

该图展示了实验整体设计、手术流程及类器官培养特性。实验以 EGFP 转基因小鼠为供体，C57BL/6 小鼠为受体，移植后 2、7、28 天进行组织学评估;手术通过 EDTA 处理剥离结肠上皮，保留肌肉层完整，随后注入类器官细胞。膀胱类器官培养 6-7 天呈现球形及分支形态，EGFP⁺类器官荧光信号清晰;免疫荧光显示，培养的类器官高表达基底细胞标志物 CK5 和未成熟尿路上皮标志物 CK14，不表达成熟尿路上皮标志物 UPK3，符合基底型类器官表型特征。

图2：术后 2 天移植部位组织学评估

术后 2 天荧光观察显示，EGFP⁺类器官细胞已附着于结肠腔面形成细胞簇;免疫荧光染色证实，这些 EGFP⁺细胞表达上皮细胞标志物 E - 钙粘蛋白，表明移植细胞初步形成上皮样结构，但尚未形成多层组织，Ki67⁺细胞比例极低(0.27%±0.61%)，增殖活性较弱。

图3：术后 28 天移植细胞的尿路上皮特征

术后 28 天，EGFP⁺细胞在结肠腔面形成多层结构，形态类似膀胱移行上皮，无结肠上皮特有的隐窝和杯状细胞;免疫荧光显示，EGFP⁺区域高表达 CK5 和 CK14，不表达结肠上皮标志物 CA2 和成熟尿路上皮标志物 UPK3，且细胞位于层粘连蛋白阳性的基底膜上方，证实移植细胞成功重建尿路上皮组织，未获得结肠上皮特征，呈现未成熟尿路上皮表型。

图4：移植细胞的增殖与再生能力

定量分析显示，EGFP⁺细胞层数随时间逐渐增加，从术后 2 天的 1.68±1.04 层增至 28 天的 4.58±1.3 层，部分区域可达 8 层，超过正常成年小鼠膀胱尿路上皮层数(2-7 层)。Ki67⁺细胞比例在术后 7 天达到峰值(26.0%±13.0%)，显著高于新生小鼠膀胱尿路上皮(15.9%±3.51%)，28 天仍维持在 18.4%±7.4%;Ki67⁺细胞主要分布于基底膜附近，呈有序增殖模式，无异常增生或恶性转化特征，表明移植细胞具有活跃且可控的再生能力。

全文总结

本研究首次建立了膀胱类器官在去上皮化小鼠结肠的稳定移植技术，通过 EDTA 介导的结肠上皮剥离结合类器官注射，实现了尿路上皮组织在结肠部位的重建。移植的膀胱类器官可形成多层尿路上皮结构，高表达基底细胞和未成熟尿路上皮标志物，不表达结肠上皮特征，且细胞保持活跃的增殖能力，主要在基底膜附近有序增殖，无异常增生表现。该技术成功规避了传统膀胱扩大术使用胃肠道组织带来的并发症风险，为开发新型自体膀胱扩大术提供了可行方案 —— 通过培养患者自身膀胱类器官并移植到去上皮化的结肠段，可构建尿路上皮化的结肠组织用于膀胱扩大，从根本上减少结石形成和恶性转化的可能性。但研究随访时间仅 28 天，需进一步开展长期实验验证移植组织的稳定性和功能完整性，后续还需在大型动物模型中优化技术方案，为临床转化奠定基础。