肠道上皮类器官共培养体系：肠上皮内淋巴细胞高效扩增与运动分析的新工具

研究背景

肠上皮内淋巴细胞(IELs)是肠道黏膜免疫的关键组成部分，分布于肠上皮细胞间，可分为 αβT 和 γδT 两个主要亚群，在调节局部免疫应答、维持肠道屏障功能中发挥重要作用。但 IELs 分离后极易凋亡，体外培养难度大，传统培养系统缺乏肠道上皮细胞提供的生理微环境，无法维持其存活、增殖及正常功能，严重限制了对其动态行为及与上皮细胞相互作用的研究。现有类器官技术可长期培养具有生理功能的肠道上皮细胞，但尚未应用于 IELs 的共培养研究，亟需开发新型共培养体系以填补这一空白。

这篇发表在《Journal of Gastroenterology》上题为Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes的文章，首次建立了肠道上皮类器官与肠上皮内淋巴细胞(IELs)的 3D 共培养体系，实现了 IELs 的高效体外扩增与动态运动分析，为深入研究 IELs 与肠道上皮细胞(IECs)的时空相互作用及免疫调控机制提供了贴近体内生理状态的新型体外模型。

实验方法

肠道上皮类器官培养：分离 C57BL/6 小鼠小肠隐窝，接种于 Matrigel 中，添加含 mRspo1、EGF、Noggin 的 Advanced DMEM/F12 培养基培养 2 天，形成 3D 类器官。

IELs 分离与分选：从小鼠小肠分离 IELs，经 EDTA/DTT 处理、过滤及 Percoll 梯度离心纯化;通过流式细胞术分选 αβT 和 γδT IEL 亚群，确保纯度>99%。

共培养体系建立：将类器官与 IELs 按 100 个类器官 / 1.0×10⁵个 IELs 的比例混合，接种于 Matrigel 中，添加含 IL-2、IL-7、IL-15(或单独 / 组合)的培养基，每 2 天换液，共培养 14 天。

细胞表征与增殖分析：通过免疫荧光染色检测 IELs 标志物(CD3)表达;流式细胞术分析 IELs 亚群比例(αβT/γδT)及增殖标志物(Ki-67)表达;计数不同时间点 IELs 数量，评估扩增效率。

动态运动分析：采用延时荧光成像(单平面 / 多平面)观察 IELs 在共培养体系中的运动行为;通过 Imaris 软件进行细胞追踪，量化平均速度、最大速度、轨迹长度等运动参数。

关键结果

图1：类器官支持 IELs 体外存活与定位

该图展示了共培养体系的建立及 IELs 的分布特征。将 EGFP 转基因小鼠来源的 IELs 与野生型小鼠类器官共培养 3 天后，免疫荧光染色显示 EGFP⁺IELs(CD3⁺)不仅可嵌入类器官内部，还可分布于类器官外部区域，证实类器官能为 IELs 提供存活微环境。但未添加细胞因子时，7 天后 IELs 数量显著减少，提示需优化培养条件以延长其存活时间。

图2：IL-2/7/15 协同促进 IELs 扩增

细胞因子干预实验显示，单独添加 IL-2、IL-7 或 IL-15 均能促进 IELs 存活，其中 IL-2 效果最显著;三者联合使用时呈协同效应，IELs 数量在 7 天内增加 2-3 倍，14 天内累计扩增约 4 倍，且 αβT 和 γδT 亚群比例保持稳定，与培养前无显著差异。Ki-67 染色证实两亚群均存在增殖活性，共培养体系可同时维持两类 IELs 的增殖能力。

图3：IELs 在共培养体系中的动态迁移行为

延时荧光成像显示，共培养 2 天后 IELs 呈现高度活跃的运动特性：部分 IELs 向类器官迁移、短暂停留后迁出;部分则沿类器官基底侧随机多方向移动，且可通过细胞质突起插入相邻上皮细胞间。4D 成像进一步证实 IELs 在 3D 空间内的持续形态变化与动态迁移，再现了其在体内肠道上皮中的运动特征。

图4：IELs 运动参数的定量分析

通过三维细胞追踪分析，量化了 IELs 的运动参数：整体平均速度为 5.07±0.27μm/min，最大速度达 9.67±0.60μm/min;αβT 和 γδT IELs 的平均速度、轨迹长度、位移等参数无显著差异，表明两亚群运动特性相似。培养 15 天后，IELs 仍保持稳定的运动能力，证实该共培养体系可长期维持其生理活性。

全文总结

本研究成功建立了肠道上皮类器官与 IELs 的 3D 共培养体系，该体系通过肠道上皮类器官提供生理微环境，结合 IL-2、IL-7、IL-15 协同作用，实现了 αβT 和 γδT IELs 的高效体外扩增，解决了 IELs 体外易凋亡、难以长期培养的难题。通过延时荧光成像与细胞追踪技术，首次在体外直观呈现了 IELs 沿类器官基底侧随机迁移、嵌入 / 迁出类器官等动态行为，且证实两亚群运动特性无显著差异。该体系贴近体内生理状态，可用于研究 IELs 与肠道上皮细胞的时空相互作用、免疫调控机制及动态功能，为肠道黏膜免疫相关疾病的机制研究及药物筛选提供了可靠工具。但该体系未包含肠道间质细胞等其他组分，无法完全模拟体内复杂的肠道微环境，未来需进一步优化以纳入更多免疫细胞及间质成分，提升模型的生理相关性。