肠道类器官 EMT 模型：肠道纤维化研究的新型体外工具

研究背景

肠道纤维化是炎症性肠病(IBD)的常见并发症，可导致肠狭窄、梗阻等严重后果，显著降低患者生活质量并增加病死率，但目前尚无 FDA 批准的抗纤维化药物。现有研究模型存在明显局限：二维细胞模型无法再现肠道 3D 结构及多细胞组成，体内模型(如 TNBS 诱导模型)成本高、效率低且难以模拟人类病理生理特征。EMT(尤其是 2 型 EMT)是肠道纤维化的关键机制，上皮细胞通过 EMT 转化为产胶原的肌成纤维细胞，但现有 EMT 体外模型多采用永生化细胞系，基因表达及生理响应与原代细胞存在差异，亟需开发基于原代细胞的 3D EMT 模型以填补研究空白。

这篇发表在《Scientific Reports》上题为Organoid-based epithelial to mesenchymal transition (OEMT) model: from an intestinal fibrosis perspective的研究，首次建立了基于肠道上皮类器官(IEOs)的上皮 - 间质转化(EMT)模型(OEMT)，通过肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)预处理联合转化生长因子 -β1(TGF-β1)处理，高效诱导类器官发生 EMT，为肠道纤维化机制研究及抗纤维化药物筛选提供了贴近体内生理状态的 3D 体外模型。

实验方法

肠道上皮类器官(IEOs)培养：分离 C57Bl/6 小鼠小肠及结肠隐窝，接种于 Matrigel 中，在 Intesticult™ OGM 培养基中培养，形成包含肠道所有上皮细胞类型的 3D 类器官;通过免疫荧光染色验证类器官中增殖细胞(Ki67)、干细胞(Lgr5)及各类功能细胞标志物的表达。

细胞因子处理与 EMT 诱导：设置不同浓度 TGF-β1 处理 IEOs，观察类器官形态变化及 EMT 效率;采用 TNF-α 预处理(第 1 天)联合 TGF-β1 处理(第 2 天)的序贯方案诱导 EMT，设置单独 TGF-β1 处理组、反向处理组(先 TGF-β1 后 TNF-α)作为对照;同时建立 LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬细胞与 IEOs 共培养体系，探究巨噬细胞分泌因子的协同作用。

抑制剂干预实验：使用 ERK 抑制剂(PD98059)、p38 抑制剂(SB202190)、NF-κB 抑制剂(QNZ)及 CFTR 抑制剂(格列本脲)，分别干预细胞因子处理过程，通过免疫荧光和 qRT-PCR 检测 EMT 标志物表达变化，解析相关信号通路。

分子与形态学检测：免疫荧光染色检测 EMT 标志物(α-SMA、波形蛋白)及增殖标志物(Ki67)表达;ELISA 检测共培养体系中 TNF-α 浓度;qRT-PCR 分析 EMT 相关转录因子(Twist1/2、Snai1/2 等)及效应基因(N - 钙粘蛋白、MMP2 等)的 mRNA 表达水平;动态观察类器官形态变化及细胞迁移能力。

关键结果

图1：TGF-β1 对 IEOs 的损伤效应

该图显示 TGF-β1 以浓度和时间依赖方式诱导 IEOs 破裂死亡，而非高效诱导 EMT。1ng/ml TGF-β1 处理 48 小时后，约 90% 类器官破裂，仅约 10% 破裂后的克隆中出现少量梭形间质样细胞;浓度越高、处理时间越长，类器官存活率越低，表明单独 TGF-β1 主要导致类器官损伤，EMT 诱导效率极低。免疫荧光证实 IEOs 包含肠道所有上皮细胞类型，确保模型具备肠道上皮生理特征。

图2：巨噬细胞分泌因子对 EMT 的协同诱导作用

巨噬细胞与 IEOs 共培养后，培养基中 TNF-α 浓度显著升高，且 TNF-α 中和抗体可阻断这一效应。共培养体系中，TGF-β1 处理的 IEOs 间质样细胞数量、α-SMA 阳性克隆比例(3.2 倍)均显著高于单独 TGF-β1 处理组，波形蛋白和 F-actin 染色也证实间质表型增强;而添加 TNF-α 中和抗体后，α-SMA 阳性克隆比例降至单独 TGF-β1 处理水平，表明巨噬细胞分泌的 TNF-α 是协同诱导 EMT 的关键因子。

图3：TNF-α 预处理对 EMT 的增强效应及处理顺序依赖性

TNF-α 预处理(第 1 天)联合 TGF-β1 处理(第 2 天)可显著增加 IEOs 间质样细胞数量及迁移能力，α-SMA 阳性克隆(1.57 倍)和 Ki67 阳性克隆(2.89 倍)比例均显著高于单独 TGF-β1 处理组。若颠倒处理顺序(先 TGF-β1 后 TNF-α)，则无 EMT 表型出现，α-SMA 阳性克隆比例显著降低，证实 TNF-α 预处理是高效诱导 EMT 的关键，且处理顺序对 EMT 效率至关重要。

图4：结肠类器官(cIEOs)的 EMT 验证

在小鼠结肠来源的类器官中，TNF-α 预处理联合 TGF-β1 处理同样可高效诱导 EMT：间质样细胞数量增加，α-SMA 阳性克隆(2.0 倍)和 Ki67 阳性克隆(1.7 倍)比例显著高于单独 TGF-β1 处理组，与小肠类器官结果一致，证实该 OEMT 模型适用于不同肠道段来源的类器官，具有普适性。

图5：TNF-α 单独处理对 IEOs 形态的影响

TNF-α 单独处理可诱导 IEOs 呈现球形形态，减少芽体形成，且呈剂量依赖性：高剂量 TNF-α 处理组球形类器官比例更高，芽体类器官比例更低;添加 TNF-α 中和抗体可逆转这一形态变化。移除 TNF-α 后，球形类器官 12 小时内开始收缩，1 天内恢复多叶状形态;CFTR 抑制剂(格列本脲)处理可降低球形类器官比例，表明 TNF-α 通过激活 CFTR 通道、增加肠腔液体分泌导致球形形态改变，同时可能通过破坏细胞连接为 EMT 奠定基础。

图6：TNF-α 诱导 EMT 的分子机制

抑制剂实验显示，p38 抑制剂(SB202190)可显著降低 α-SMA 阳性克隆比例(0.62 倍)，ERK 抑制剂(PD98059)轻度降低(0.11 倍)，NF-κB 抑制剂(QNZ)则完全阻断 α-SMA 表达;qRT-PCR 结果显示，TNF-α 处理可上调 EMT 相关转录因子 Snai2 及效应基因 N - 钙粘蛋白、α-SMA、MMP2 的 mRNA 表达，而上述抑制剂可逆转这一效应，证实 TNF-α 通过激活 p38、ERK 及 NF-κB 通路，上调 EMT 相关基因表达，协同 TGF-β1 诱导 EMT。

全文总结

本研究成功建立了基于肠道上皮类器官的 OEMT 模型，通过 TNF-α 预处理联合 TGF-β1 序贯处理，高效诱导类器官发生 EMT，解决了单独 TGF-β1 诱导效率低、易导致类器官破裂的问题。该模型再现了肠道纤维化过程中 EMT 的关键特征，且适用于小肠和结肠类器官，具备良好的普适性。机制研究表明，TNF-α 通过激活 p38/ERK/NF-κB 通路，上调 Snai2 等 EMT 转录因子及下游效应基因表达，同时破坏细胞连接、改变类器官形态，为 TGF-β1 诱导 EMT 创造条件。与现有模型相比，OEMT 模型基于原代肠道上皮细胞，保留 3D 结构及生理特征，操作简便、成本较低，可用于高通量抗纤维化药物筛选及 EMT 相关机制研究。但该模型未包含肠道间质细胞，无法模拟上皮 - 间质细胞间的复杂相互作用，未来需进一步构建包含多种细胞类型的类器官组装体，以更贴近体内肠道微环境。