人呼吸道类器官揭秘 WUPyV 感染机制：为潜在致病菌防控提供新视角

研究背景

华盛顿大学多瘤病毒(WUPyV)是一种可感染人类呼吸道的多瘤病毒科成员，在人群中流行率较高，可在呼吸道感染患者的痰液、鼻咽抽吸物中检测到，也存在于血液、尿液等多种非呼吸道标本中。但由于其体外培养条件苛刻，致病性和病因学尚未完全明确，目前被视为机会性呼吸道病原体。已有临床案例显示，WUPyV 可能与新生儿重症监护患者及致命感染相关，且在全球范围内持续循环，其感染机制和致病潜力亟待深入研究。现有研究缺乏稳定的体外培养系统，限制了对其感染过程和致病机制的探索，亟需建立可靠模型以填补这一空白。

这篇发表在《Journal of Medical Virology》题为Cytopathic Effect and Morphogenesis of WUPyV in Human Airway Epithelial Cells的文章，利用人呼吸道类器官(HAOs)和呼吸道上皮细胞(HAE)模型，首次明确华盛顿大学多瘤病毒(WUPyV)通过网格蛋白介导的内吞作用入侵细胞，揭示其复制动态、细胞嗜性及形态发生机制，证实其对呼吸道上皮的显著损伤作用。

实验方法

细胞培养与病毒纯化：培养人呼吸道上皮细胞(HAE)并构建人呼吸道类器官(HAOs)模型;复苏并增殖 WUPyV 菌株 BJ0771，通过超速离心纯化病毒颗粒，采用实时荧光定量 PCR(qPCR)检测 VP1 基因拷贝数以确定病毒滴度。

病毒感染与复制动态监测：将不同感染复数(MOI)的 WUPyV 分别感染 HAE 和 HAOs 模型，在指定时间点收集顶端冲洗液，提取病毒核酸并通过 qPCR 定量，分析病毒复制动力学特征。

抑制剂干预实验：感染前 2 小时，在 HAE 模型的顶端和基底侧加入靶向不同内吞途径、内体酸化及酪氨酸激酶的小分子抑制剂;感染后持续培养并维持抑制剂存在，定期收集病毒并检测拷贝数，评估抑制剂对病毒感染的影响。

形态学与免疫学分析：感染后固定样本，进行 HE 染色和免疫组织化学(IHC)检测，观察组织形态和病毒抗原分布;通过免疫荧光染色标记病毒 VP1 蛋白与不同细胞类型标志物、紧密连接标志物及溶酶体标志物，共聚焦显微镜观察病毒定位与细胞相互作用。

电镜观察：采用负染法观察纯化病毒颗粒形态;制备感染细胞的超薄切片，通过透射电子显微镜(TEM)观察病毒入侵、 intracellular 转运及释放过程;利用扫描电子显微镜(SEM)观察感染后呼吸道上皮的超微结构损伤。

关键结果

图1：WUPyV 在 HAE 和 HAOs 中的复制动态与形态特征

该图展示了 WUPyV 在不同 MOI 下的复制动力学及病毒颗粒形态。qPCR 结果显示，除 MOI=1 组外，其余各组病毒滴度在感染后 2-3 天开始显著升高，5-7 天达到峰值并维持高位，表明 WUPyV 在 HAE 中复制能力强;与 HAE 相比，HAOs 中病毒感染进展更慢但持续时间更长。负染电镜观察到病毒颗粒呈球形，直径约 45nm，具有典型的多瘤病毒衣壳结构，同时可见空心衣壳和衣壳亚基组成的管状结构。HE 染色和 IHC 结果显示，感染后 HAE 结构破坏、纤毛稀疏紊乱，HAOs 细胞核明显增大，病毒抗原主要定位于感染细胞的细胞核区域。

图2：WUPyV 的细胞嗜性

免疫荧光染色结果显示，WUPyV 的 VP1 蛋白与 HAE 中纤毛细胞标志物(β- 微管蛋白)、基底细胞标志物(p63)及杯状细胞标志物(Muc5AC)均存在共定位，表明病毒可感染呼吸道上皮的多种细胞类型。TEM 观察进一步证实，基底细胞、分泌细胞和纤毛细胞中均存在感染迹象，可见病毒颗粒和包涵体。在 HAOs 模型中，红色荧光标记的病毒同样与多种细胞类型标志物共定位，验证了 WUPyV 对呼吸道多种细胞亚型的感染能力，且两种模型均对病毒高度易感。

图3：WUPyV 的内吞入侵机制

抑制剂干预实验表明，网格蛋白介导的内吞作用(CME)抑制剂(Pitstop2 和氯丙嗪)可剂量依赖性抑制病毒复制，高剂量组病毒拷贝数随时间逐渐降低;而小窝蛋白 / 脂筏介导的内吞抑制剂(制霉菌素、MβCD 等)对病毒复制无显著影响，仅高剂量孕酮轻微抑制感染;巨胞饮作用抑制剂(EIPA 和 IPA-3)对病毒感染无影响，而酪氨酸激酶抑制剂(染料木黄酮)显著抑制病毒复制。TEM 观察显示，病毒颗粒吸附于细胞膜微绒毛表面，可通过网格蛋白包被凹陷和囊泡进入细胞，证实 WUPyV 主要通过网格蛋白介导的内吞作用入侵，且依赖酪氨酸激酶活性，是第二种已知采用该方式入侵的人类多瘤病毒。

图4：WUPyV 的细胞内转运与核复制

免疫荧光共染色显示，WUPyV VP1 蛋白与溶酶体标志物 M6PR 存在共定位;内体酸化抑制剂(NH₄Cl 和巴佛洛霉素 A1)可剂量依赖性抑制病毒感染，TEM 观察到细胞质囊泡和溶酶体中存在病毒颗粒，表明病毒依赖内体酸化进行转运。TUNEL 检测显示，病毒感染可诱导细胞凋亡，凋亡细胞核与 VP1 蛋白大量共定位;TEM 显示感染细胞出现染色质浓缩等凋亡特征，细胞核内可见病毒颗粒，核孔附近存在组装的病毒颗粒，证实病毒被转运至细胞核进行复制和组装，凋亡可能促进病毒从核内释放。

图5：WUPyV 的释放途径与呼吸道上皮损伤

免疫荧光显示，感染后细胞紧密连接标志物 ZO1 连续性破坏，部分细胞细胞膜完整性受损，病毒颗粒从破损处释放，同时可见含病毒的分泌囊泡突出于细胞表面。TEM 观察证实 WUPyV 通过多种途径释放：囊泡突起释放、细胞裂解释放及间隙释放。SEM 观察显示，低滴度感染导致纤毛扁平、稀疏紊乱，高滴度感染可造成纤毛广泛破坏，覆盖率降至 10% 以下，部分区域完全无纤毛，细胞表面微绒毛稀疏，呼吸道上皮正常结构被严重破坏。

全文总结

本研究利用人呼吸道类器官和上皮细胞模型，系统阐明了 WUPyV 的感染机制和致病特征。研究证实 WUPyV 可高效感染呼吸道上皮的多种细胞类型，包括纤毛细胞、基底细胞和分泌细胞，其入侵依赖网格蛋白介导的内吞作用，独立于巨胞饮和小窝蛋白 / 脂筏介导的内吞途径，且需要酪氨酸激酶活性和内体酸化参与。病毒进入细胞后经溶酶体转运至细胞核进行复制和组装，通过囊泡释放、细胞裂解等多种方式释放到细胞外，高滴度感染可导致呼吸道上皮结构严重破坏，纤毛大量丢失，证实其具有显著的致病潜力。该研究首次在天然宿主模型中可视化 WUPyV 的形态发生过程，填补了其感染机制研究的空白，为将其视为被低估的人类病原体提供了关键证据，同时为开发针对性防控策略和抗病毒药物提供了理论基础和实验模型。但研究未明确病毒入侵的特异性受体，且类器官模型无法完全模拟体内复杂微环境，未来需进一步探索病毒受体及体内感染机制。