小鼠嗅上皮类器官培养新方案：助力神经元分化研究的高效工具

研究背景

嗅上皮是体内少数终生保持神经发生能力的组织之一，其含有的干细胞可持续生成嗅觉感觉神经元，是研究上皮神经发生的理想模型。传统嗅上皮相关研究依赖体内实验或复杂的细胞纯化流程，存在操作繁琐、重复性差、难以精准控制实验条件等问题。现有类器官培养方法多需转基因动物或流式细胞分选纯化细胞，成本高且步骤复杂，限制了其广泛应用。因此，开发一种简便、高效、无需复杂纯化步骤的嗅上皮类器官培养方案，对推动嗅觉相关生理及病理机制研究具有重要意义。

这篇发表在《STAR Protocols》上题为Protocol for culturing olfactory epithelium organoids supporting neuronal differentiation的研究，建立了一种高效稳定的小鼠嗅上皮(OE)3D 类器官培养方案，无需荧光激活细胞分选，可支持神经元分化，为上皮神经发生机制研究提供了可靠模型。

实验方法

嗅黏膜获取(25 分钟 / 只小鼠)：CO₂麻醉处死 5-8 周龄小鼠，经心脏灌注 PBS 去除血液后断头;剥离头部皮肤，移除眼球、颧骨、牙齿及下颌等组织，暴露颅骨并小心剪开，取出大脑及嗅球，分离鼻中隔与鼻甲组织，去除呼吸上皮，保留嗅上皮组织。

组织解离(40 分钟)：将分离的嗅上皮组织剪碎，加入木瓜蛋白酶解离液，37℃温和振荡孵育 30 分钟(分两次 15 分钟，中间轻柔吹打);孵育后自然沉降，收集上清液离心，沉淀用含抗生素的 DMEM/F12 培养基重悬，台盼蓝染色计数活细胞。

类器官培养(1 周)：按 75000 个细胞 / 孔的密度接种到 8 孔 chamber 玻片，使用含 4% Cultrex 基质的生长培养基培养;接种次日添加不含 Cultrex 的生长培养基，后续每两天更换一次不含 Cultrex 的培养基，37℃、5% CO₂湿润环境中培养 7 天。

类器官固定(即时)：培养第 7 天，吸弃培养基，加入 pH 7.2-7.4 的 4% 多聚甲醛(PFA)室温固定 15 分钟，随后用 PBST 洗涤 15 分钟以实现透化。

免疫染色(3 小时至过夜)：将固定透化后的类器官与一抗溶液室温孵育 1 小时或 4℃过夜，PBST 洗涤 3 次;加入二抗溶液室温孵育 1 小时，PBST 洗涤 1-3 次;移除 chamber 玻片框架，荧光封片剂封片后用于成像分析。

关键结果

图1：嗅上皮解剖所需设备

该图展示了实验所需的全套解剖工具，包括自制解剖板、20G 针头、咬骨钳、精细镊子、弹簧剪、手术刀、培养皿及注射器等。其中，20G 针头用于固定小鼠四肢，咬骨钳用于破碎骨骼， Dumont #5 精细镊子用于精准分离组织，特制钝头注射器用于心脏灌注，这些工具的合理搭配确保了嗅上皮组织的高效精准获取，为后续实验奠定基础。

图2-8：嗅上皮组织分离流程

系列图示详细呈现了从心脏灌注到嗅上皮分离的完整步骤：图 2 展示胸腔打开暴露心脏的灌注准备过程，需在右心房和左心室切口以保证灌注顺畅;图 3-7 依次为头部皮肤剥离、颧骨及下颌去除、颅骨剪开、上颌骨分离、鼻骨移除等操作，关键在于避免损伤鼻甲和鼻中隔组织;图 8 显示最终分离的鼻中隔与鼻甲，可清晰区分黄色的嗅上皮与透明的呼吸上皮，通过剪切分离鼻甲与鼻中隔并去除呼吸上皮，获得纯净的嗅上皮样本。

图9：细胞接种密度对比

该图对比了 25000 个 / 孔与 75000 个 / 孔两种接种密度的培养效果，75000 个 / 孔的接种密度能形成更多结构完整的类器官，而 25000 个 / 孔密度下类器官数量少且分布稀疏。实验证实 75000 个 / 孔为最优接种密度，可保证类器官均匀生长且避免过度拥挤，为类器官形成提供理想条件。

图10-11：类器官培养过程监测

图 10 展示了含 Cultrex 培养基接种后的培养孔状态，底部可见光亮的基质层，换液时需避开该层以避免损伤附着的细胞;图 11 为不同培养天数的明场显微镜图像，培养 1 天主要为单个细胞和组织碎片，2 天仍有较多碎片，4 天可见中空球形结构(类器官)形成，7 天细胞形成细胞垫，类器官结构清晰，可通过形态区分(类器官呈球形、中心中空，碎片边界不规则且易漂浮)。

图12：类器官免疫荧光染色结果

免疫染色结果显示，培养 7 天的类器官中，TUJ1(神经元标志物)阳性细胞大量存在，证实类器官支持神经元分化;同时检测到 KRT14(基底细胞标志物)和 Sox2(干细胞 / 祖细胞标志物)阳性细胞，表明类器官保留了嗅上皮的干细胞与基底细胞群体。无论使用含或不含视黄酸的 B27 添加剂，类器官均能正常分化出神经元，且细胞形态与标志物表达无明显差异，验证了方案的稳定性与灵活性。

全文总结

本研究建立了一套高效、简便的小鼠嗅上皮类器官培养方案，通过精准的组织分离、优化的解离条件及标准化的培养流程，成功构建支持神经元分化的 3D 类器官模型。该方案无需荧光激活细胞分选或转基因动物，成本较低且重复性好，接种 7 天后即可获得含干细胞、基底细胞及未成熟嗅觉感觉神经元的类器官，且类器官附着于培养基质，便于后续观察与分析。研究同时明确了最优接种密度(75000 个 / 孔)、培养基成分及固定染色关键参数，为实验重复性提供保障。但该方案也存在局限，无法生成支持细胞、腺体细胞等其他嗅上皮细胞类型，且无法培养出成熟嗅觉感觉神经元，仅适用于小鼠细胞，难以直接应用于人类细胞。总体而言，该方案为嗅上皮神经发生机制研究提供了可靠工具，有望推动嗅觉相关疾病模型构建与药物筛选研究。