空间有序的三重保险：新型生物发光探针实现肿瘤“三证齐全”才发光

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：A Spatially Ordered Three-Input Logic Gate for Highly Specific and Sensitive Breast Tumor Imaging

中文标题：一种用于高度特异性和灵敏性乳腺肿瘤成像的空间有序三输入逻辑门

发表期刊：《Analytical Chemistry (ACS)》

影响因子：6.7

作者单位：

1.State Key Laboratory of Digital Medical Engineering, School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, China

2.Key Laboratory of Optic-Electric Sensing and Analytical Chemistry for Life Science, MOE, Shandong Key Laboratory of Biochemical Analysis, College of Chemistry and Molecular Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao, China

3.State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing, China

作者信息：

第一作者(共同第一)：Hongzhe Yan, Xiaoyang Liu

通讯作者：Caifeng Ding, Gaolin Liang

研究背景

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，现有临床诊断方法存在不足：有创穿刺活检可能促进转移;无创影像(PET、CT、MRI)存在分辨率低、辐射、缺乏功能信息或特异性差等问题。生物发光成像(BLI)具有高信噪比和高灵敏度，但特异性仍需提升。为提高肿瘤成像的特异性，作者设计了基于肿瘤相关酶和荧光素酶的顺序激活三输入逻辑门探针KK(GGR)-Luc。三个输入分别为：细胞膜上过表达的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、溶酶体中过表达的组织蛋白酶B(CTB)以及细胞质中转染的萤火虫荧光素酶(fLuc)。探针只有在三个输入空间有序依次作用后才能产生生物发光信号，从而实现高度特异和灵敏的乳腺肿瘤成像。

研究方法

设计并合成了三输入逻辑门探针KK(GGR)-Luc，其结构包括：uPA响应序列GGR、CTB响应序列Cbz-KK、以及D-氨基荧光素(D-AmLuc)。通过HPLC验证酶切顺序和正交性。使用fLuc转染的4T1小鼠乳腺癌细胞和正常L929细胞，通过MTT评估细胞毒性。利用共聚焦显微镜观察探针在细胞内的定位(溶酶体示踪剂)。通过流式细胞术和抑制剂(CPZ、MβCD、amiloride、低温)研究细胞摄取机制。在细胞和活体水平，分别使用抑制剂(4-CPG抑制uPA、CA-074-Me抑制CTB)预处理，然后加入探针，通过IVIS小动物成像系统记录生物发光信号，计算半衰期和信号倍数。同时进行血常规分析和H&E染色评估生物安全性。

实验结果

图 1：三输入逻辑门的设计原理

KK(GGR)-Luc依次响应三个空间定位不同的输入：细胞膜上的uPA切割GGR侧链，暴露Cbz-KK;进入溶酶体后CTB切割Cbz-KK，释放自由的D-氨基荧光素;最后在细胞质中fLuc的催化下与ATP和O₂反应产生生物发光。三个输入缺一不可，保证了成像的高度特异性。

图 2：体外验证酶切顺序、选择性和正交性

HPLC显示：KK(GGR)-Luc + uPA → KK-Luc(新峰);KK-Luc + CTB → D-AmLuc(新峰);而KK(GGR)-Luc + CTB或KK-Luc + uPA无新峰，证明前两个输入的顺序和正交性。BL强度测试：KK(GGR)-Luc仅在uPA存在时显著发光(9.3倍于其他物质);KK-Luc仅在CTB存在时显著发光(12.5倍)。fLuc转染的4T1细胞裂解液使KK(GGR)-Luc的BL增强690倍，而加入uPA或CTB抑制剂后信号被显著抑制，证实三个输入缺一不可。

图 3：探针在细胞内的定位和内吞机制

共聚焦显示，2小时探针与溶酶体高度共定位(PCC=0.93)，4小时和8小时共定位降低(0.79、0.57)，表明成功实现溶酶体逃逸(可能由于正电荷引发的质子海绵效应)。流式细胞术表明，MβCD(抑制小窝蛋白介导的内吞)和4°C处理显著降低细胞摄取，说明探针主要通过能量依赖的小窝蛋白介导的内吞进入细胞。

图 4：细胞水平的三输入逻辑门成像

在fLuc转染的4T1细胞中，KK(GGR)-Luc组在7.5分钟达到最高BL强度，比单抑制剂组(uPA抑制剂或CTB抑制剂)高4.4倍，比双抑制剂组高更多。该组的BL半衰期长达117.2分钟，远长于抑制剂组，证明三输入顺序激活可产生持久信号。

图 5：活体水平的三输入逻辑门成像

在皮下4T1荷瘤裸鼠中，静脉注射KK(GGR)-Luc后15分钟肿瘤区BL信号达到峰值。抑制剂预处理组(uPA抑制剂、CTB抑制剂或两者联用)的BL信号显著降低，G1组信号分别为G2、G3、G4组的5.6、5.0、6.3倍。离体肿瘤成像显示，G1组肿瘤BL强度是G2、G3、G4组的2.5、4.2、15.5倍。主要器官无显著BL信号，表明探针仅在肿瘤区域特异性激活。血常规和H&E染色证实探针具有良好的生物安全性。

研究结论

本研究设计了一种空间有序的三输入逻辑门探针KK(GGR)-Luc，依次响应肿瘤细胞膜上的uPA、溶酶体内的CTB和细胞质中的萤火虫荧光素酶(fLuc)，只有三个输入同时存在且顺序正确时才能释放自由的D-氨基荧光素并产生生物发光信号。体外HPLC、选择性实验和BL光谱证实了酶切顺序的正交性和三输入的必要性。细胞成像显示该探针在fLuc转染的4T1细胞中BL信号比抑制组高3.5倍以上，半衰期达117.2分钟。活体成像中，肿瘤区信号比抑制组高5倍以上，且信号仅局限于肿瘤，主要器官无信号。该工作首次将空间有序三输入逻辑门应用于乳腺癌的高特异性和高灵敏生物发光成像，为精准肿瘤诊断提供了新策略。