攻克甲肝病毒体外增殖难题：HAV-2m让反向遗传学成为可能

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：An engineered human hepatitis A virus capable of rapid proliferation in vitro and causing hepatitis in mice

中文标题：一种能够在体外快速增殖并在小鼠中引起肝炎的工程化人甲型肝炎病毒

发表期刊：《JHEP Reports》

影响因子：7.5

作者单位：

1.School of Basic Medicine Sciences, Tsinghua University, Beijing, China

State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, China

2.School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, Hefei, China

Research Unit of Discovery and Tracing of Natural Focus Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, China

作者信息：

第一作者(共同第一)：Jian Li, Pei-Yu Jiang, Xiu-Li Yan

通讯作者：Hui Zhao, Cheng-Feng Qin

研究背景

甲型肝炎病毒(HAV)仍然是全球性的公共卫生威胁。虽然HM175-mp4株系可在Ifnar1-/-小鼠中引起类似人类甲型肝炎的症状，但该病毒在体外复制极其缓慢(直接转染其基因组RNA需要120天才能获得活病毒)，导致病毒储备必须通过动物传代制备，严重限制了反向遗传学研究和应用。本研究旨在通过理性突变，构建一种既能高效体外增殖、又能在小鼠中引起肝炎的基因可操作HAV模型。

研究方法

在HM175-mp4全长cDNA克隆中引入两个已知的细胞适应性突变：2B蛋白的A1052V和2C蛋白的F1163S，构建重组病毒HAV-2m。将体外转录的RNA转染Huh7.5.1细胞，通过检测病毒RNA拷贝数和VP1免疫荧光评估增殖能力。同时构建携带萤火虫荧光素酶(Fluc)报告基因的亚基因组复制子(repFluc)，通过检测荧光素酶活性验证复制效率。将HAV-2m静脉注射入Ifnar1-/-小鼠，监测粪便病毒排出、血清ALT、肝脏病理和免疫细胞浸润。利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析肝脏免疫细胞动态。通过氯膦酸盐脂质体和抗体组合耗竭T细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞，评估这些细胞对肝损伤的贡献。进一步在HAV-2m基础上引入2C蛋白的K1118M突变，构建HAV-2m-K1118M，比较其在体外和体内的复制及毒力差异。

实验结果

图 1：HAV-2m的构建与体外增殖特性

将A1052V和F1163S突变引入HM175-mp4后，转染Huh7.5.1细胞，病毒RNA在6天达到2×10⁸ GE/ml(图1B)，而亲本株无增殖。免疫荧光显示VP1阳性细胞(图1C)。Fluc报告复制子实验证实repFluc-HAV-2m有强发光信号，而repFluc-mp4无(图1E)。证明这两个突变协同恢复HAV的体外复制能力。

图 2：HAV-2m在Ifnar1-/-小鼠中引起急性肝炎

静脉注射1×10⁸ GE后，血清ALT在7天开始升高，14天达峰(约10倍)，28天恢复(图2B)。粪便中持续排出病毒RNA(图2C)。肝脏H&E染色显示典型肝炎灶，活化caspase-3阳性凋亡肝细胞周围有炎症细胞浸润(图2E-F)。剂量梯度实验显示病毒载量与ALT正相关(补充图)。表明HAV-2m成功复现了人类甲型肝炎的主要特征。

图 3：单细胞测序揭示HAV-2m感染肝脏的免疫细胞图谱

感染后肝脏中T细胞(占45.97%)、NK细胞(14.18%)、单核细胞(7.67%)、Neu_Isg15细胞(7.17%)、树突状细胞(3.86%)和巨噬细胞(3.29%)显著增加(图3C-D)。GO富集显示T/NK细胞富集于淋巴细胞活化和细胞因子产生，巨噬细胞/单核细胞富集于炎症反应(图3E)。

图 4：耗竭免疫细胞不能减轻HAV诱导的肝损伤

使用氯膦酸盐脂质体和抗体耗竭T细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞后(图4A)，粪便病毒RNA在14天反而升高(图4B)，但血清ALT和肝脏病毒载量无显著差异(图4C-D)。尽管炎症灶和免疫细胞浸润减少，但凋亡肝细胞数量未变(图4E-F)。提示肝损伤不依赖于这些免疫细胞的募集。

图 5：2C蛋白第1118位是HAV的关键毒力决定簇

在HAV-2m基础上引入K1118M突变(增强体外复制的已知突变)后，HAV-2m-K1118M在Huh7.5.1细胞中复制更强(图5B)。但在小鼠中，该突变病毒在肝脏和粪便中的RNA载量均显著低于HAV-2m(图5D-E)，且不引起ALT升高和肝脏炎症(图5F-G)。单细胞测序显示其未诱导T细胞、NK细胞等大量浸润(图5I-J)。证明K1118M在体内是减毒突变，2C蛋白第1118位是重要的毒力决定簇。

研究结论

本研究通过在HM175-mp4中引入A1052V和F1163S两个细胞适应性突变，成功构建了重组病毒HAV-2m。该病毒能在Huh7.5.1细胞中高效复制(6天达2×10⁸ GE/ml)，解决了亲本株无法体外增殖的难题;同时静脉注射Ifnar1-/-小鼠可忠实再现人类甲型肝炎的症状(粪便排毒、ALT升高、肝脏炎症灶和凋亡)。单细胞测序揭示了感染后肝脏中T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和Neu_Isg15细胞的动态变化，但耗竭这些免疫细胞并不能减轻肝损伤，提示肝损伤可能由其他机制驱动。进一步利用该反向遗传学平台，发现2C蛋白的K1118M突变在体外增强复制，但在体内显著减毒(病毒载量降低、不引起肝炎)，鉴定出一个新的HAV毒力决定簇。HAV-2m系统为研究HAV发病机制和评估抗病毒策略提供了一个便捷、可基因操作的平台。