基于NanoLuc的LIPS检测方法在正汉坦病毒感染抗体检测及疫苗应答评估中的开发与应用

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Development and application of NanoLuc-based LIPS assay for antibody detection of orthohantavirus infections and vaccine responses

中文标题：基于NanoLuc的LIPS检测方法在正汉坦病毒感染抗体检测及疫苗应答评估中的开发与应用

发表期刊：《International Journal of Biological Macromolecules》

影响因子：8.5

作者单位：

1.Key Laboratory of Genetic Evolution & Animal Models, Yunnan International Joint Laboratory of Zoonotic Viruses, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming, China

2.Yunnan Key Laboratory for Zoonosis Control and Prevention, Yunnan Institute for Endemic Diseases Control and Prevention, Dali, China

3.Institute of Preventive Medicine, School of Public Health, Dali University, Dali, China

4.Kunming College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, Kunming, China

5.Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

6.Yunnan International Joint Laboratory of Zoonotic Viruses, Yunnan, China

作者信息：

第一作者(共同第一)：Shengyao Chen, Yuqiong Li, Jiebin Zhao

通讯作者：Zongti Shao, Xinglou Yang

研究背景

正汉坦病毒(Orthohantavirus, OHV)被WHO列为具有国际公共卫生紧急风险的重点病原体，可引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒心肺综合征(HCPS)。中国是HFRS的主要疫区，流行汉坦病毒(HTNV)和首尔病毒(SEOV)，近年来还发现了福贡病毒、泸西病毒等新种。传统血清学方法(ELISA、胶体金)灵敏度和特异性有限，免疫荧光和中和试验需要高等级生物安全设施。基于NanoLuc荧光素酶的免疫沉淀系统(LIPS)具有高灵敏度、高特异性、高通量等优势。本研究旨在开发一种能够同时检测多种OHV抗体的NanoLuc-LIPS方法，并评估其在临床诊断和疫苗评价中的应用价值。

研究方法

本研究将10种OHV(HTNV、SEOV、SERV、LUXV、FUGV、CABV、LIHV、XIYV、ANDV、PUUV)的核蛋白(NP)基因克隆至含分泌信号肽(SSP)、NanoLuc荧光素酶(Nluc)和His标签的pcDNA3.1载体，转染HEK293T细胞，48小时后收集含分泌型Nluc-NP-His融合蛋白的上清。LIPS检测步骤：将血清(1:50稀释)与含抗原的上清及Protein A/G琼脂糖树脂混合，4°C孵育4小时，洗涤后加入NanoLuc底物测定发光值(LU)。以健康对照的均值加3倍标准差作为cut-off值。用142份血清样本(HFRS患者、疫苗接种者、SFTS患者、恙虫病患者、健康对照)评估灵敏度、特异性、一致性和Kappa系数。通过Western blot和IFA验证蛋白表达，利用AlphaFold预测融合蛋白结构并与天然NP比对。同时与传统ELISA和胶体金试纸进行对比分析。

实验结果

图 1：OHV核蛋白的特征及融合蛋白结构

系统发育分析显示10种病毒分属PUUV、ANDV、LUXV-FUGV、HTNV-SEOV和CABV五个基因型，氨基酸相似度58.72%-96.27%。AlphaFold结构预测显示，融合蛋白中NP结构域与天然NP的RMSD为0.360-1.543(HTNV为1.543，SEOV为1.006)，表明融合设计未显著改变NP天然构象。

图 2：NanoLuc-LIPS方法的建立及检测性能

转染48小时后，10种融合蛋白的上清发光值均达到峰值(7.4×10⁶-1.1×10⁸ LU)。使用系列稀释的鼠抗HTNV或SEOV多抗检测，LIPS方法可检测至1:4.05×10⁷倍稀释，动态范围极宽。对26例SEOV-HFRS、14例HTNV-HFRS、65名疫苗接种者和12名健康对照的检测显示：HFRS患者中LIPS阳性率65.38%(与ELISA一致)，疫苗接种者中LIPS阳性率75.38%(49/65)，显著高于ELISA(35.38%)和胶体金(33.84%)。健康对照和25例其他疾病患者均为阴性。男性疫苗接种者的抗体阳性率(85.71%)显著高于女性(67.56%，P=0.002)。

Table 2 & Table 3：LIPS与传统方法性能比较

在全部142份样本中，LIPS的灵敏度为97.10%(67/69)，特异性为98.63%(72/73)，总符合率97.89%，显著优于ELISA(69.57%/100%/85.21%)和胶体金(60.87%/100%/80.89%)。Kappa分析显示：HFRS患者中LIPS与ELISA的一致性为“几乎完美”(Kappa=0.896)，疫苗接种者中为“中度”(Kappa=0.461)。ICC组间系数显示三种方法整体一致性良好(全人群ICC=0.833)。

图 3：LIPS与ELISA的相关性及ROC分析

在HTNV感染患者中，LIPS与ELISA-IgM(R²=0.6519)和ELISA-IgG(R²=0.8543)均呈良好正相关;在SEOV感染患者中相关性稍弱(R²分别为0.5668和0.3596)。疫苗接种者中LIPS与ELISA-IgG的R²=0.5939。ROC分析显示，HFRS患者和疫苗接种者的AUC分别为0.995和0.968，证明LIPS具有卓越的检测性能。

图 4：疫苗接种应答的影响因素分析

接种2-3剂疫苗的个体抗体阳性率显著高于1剂者(P=0.045)。男性在接种2-3剂后血清转化率达90.91%，女性为68.96%(P<0.001)。年龄方面，≤40岁和40-60岁组阳性率(81.82%和84.21%)高于≥60岁组(71.43%)，但未达统计学显著性(P=0.052)。疫苗对HTNV的免疫原性优于SEOV。

研究结论

本研究成功开发了一种基于NanoLuc荧光素酶的LIPS方法，用于检测10种正汉坦病毒的抗体。通过添加分泌信号肽，融合蛋白可分泌至细胞上清，免去纯化步骤，抗原产量提高10倍。NanoLuc的高灵敏度使检测阈值显著降低，动态范围达4.05×10⁷倍稀释。在142份临床样本中，LIPS的灵敏度(97.10%)和总符合率(97.89%)均显著优于ELISA和胶体金，且与ELISA具有良好的相关性(R²最高0.8543)和几乎完美的一致性(Kappa=0.896)。应用该方法发现：HFRS疫苗存在剂量-应答关系，且男性接种后抗体阳性率显著高于女性(85.71% vs. 67.56%)，提示可考虑性别特异的疫苗接种策略。该LIPS方法具有高通量、低成本、无需复杂纯化、可检测总抗体(含IgA/IgD)等优势，为汉坦病毒血清流行病学调查和疫苗效果评价提供了有力工具。