干扰素诱导的衰老CD8⁺T细胞降低早期三阴性乳腺癌抗PD-1免疫疗法的疗效

研究背景

三阴性乳腺癌(TNBC)侵袭性强、复发率高，免疫检查点阻断(ICB)治疗虽有疗效，但仅部分患者获益，且早期 TNBC 缺乏可靠的疗效预测生物标志物(PD-L1 等传统标志物预测价值有限)。早期与晚期 TNBC 的肿瘤微环境(TME)存在差异，导致免疫治疗响应机制不同，此前针对早期 TNBC 免疫治疗无响应的关键细胞亚群及机制尚未明确。

来自复旦大学附属肿瘤医院、复旦大学上海医学院、复旦大学附属第五人民医院的团队在《Science Translational Medicine》期刊上发表的这篇题为Interferon-induced senescent CD8⁺T cells reduce anti-PD1 immunotherapy efficacy in early triple-negative breast cancer的文章，通过单细胞 RNA 测序、 bulk 转录组和病理检测，在 171 例早期 TNBC 患者样本中发现，干扰素(IFN)诱导的 ISG⁺CD8⁺T 细胞富集可预测抗 PD1 免疫治疗无响应;机制上，HLA-DR⁺单核细胞产生的 IFN 触发 CD8⁺T 细胞衰老，表现为 NAD⁺过度消耗、细胞毒性降低;烟酰胺单核苷酸(NMN)可恢复该衰老 T 细胞功能，在患者来源类器官 - T 细胞共培养和小鼠模型中增强免疫治疗效果，为早期 TNBC 免疫治疗提供了新的生物标志物和联合治疗策略。

实验方法

1.临床样本与队列构建：

样本来源：171 例早期 TNBC 患者(127 例接受化疗 + 抗 PD1 治疗，44 例仅接受化疗)，6 例晚期 TNBC 患者，收集基线肿瘤活检样本;另外建立 87 例早期乳腺癌前瞻性队列用于临床验证。

检测手段：对 26 例早期 TNBC 和 6 例晚期 TNBC 样本进行单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)，55 例早期样本进行 bulk RNA-seq，153 例早期和 44 例晚期样本进行多重免疫组化(mIHC)。

2.细胞分离与培养：

分离肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞(分 ISG⁺和 ISG⁻亚群)、HLA-DR⁺单核细胞等，采用 DMEM+10% FBS 培养基培养;患者来源类器官(PDO)从新鲜肿瘤组织中分离培养。

缺氧培养条件：2% O₂、5% CO₂、93% N₂环境培养 24-72 h;部分细胞用 130 μM 去铁胺(Dfx)模拟化学缺氧。

3.功能验证实验：

体外共培养：将 ISG⁺/ISG⁻CD8⁺T 细胞与 PDO 或小鼠肿瘤细胞共培养，加入抗 PD1 抗体或 IgG2α 对照，检测肿瘤细胞活力和 IFN-γ、TNF-α 浓度。

体内动物模型：采用 TS/A、EO771、4T1 小鼠乳腺癌模型，通过过继性 T 细胞转移、抗 PD1 治疗、NMN 干预、HLA-DR⁺单核细胞 depletion 等实验，评估肿瘤生长和 T 细胞功能。

4.机制验证实验：

转录因子分析：通过 SCENIC 鉴定 IRF9 为关键调控因子，采用 siRNA 敲低 IRF9 验证其功能。

结合验证：ChIP-qPCR 检测 IRF9 与 PARP8/9/10/14 启动子的结合。

表型检测：流式细胞术检测 ISG 标志物(IFIT3、PLSCR1)、衰老标志物(CD57、KLRG1)、细胞毒性标志物(GZMB);β- 半乳糖苷酶染色、端粒长度和端粒酶活性检测验证细胞衰老。

5.NMN 干预实验：

体外：NMN 预处理 ISG⁺CD8⁺T 细胞后，检测其 NAD⁺/NADH 比值、衰老表型和功能恢复情况。

体内：通过腹腔注射 NMN(每日一次)联合抗 PD1 治疗(每周两次)，评估小鼠肿瘤生长和 TME 中 ISG⁺CD8⁺T 细胞比例变化。

6.统计分析：

采用 Wilcoxon 检验、Student’s t 检验、ANOVA 检验、Spearman 相关分析等;P<0.05 为差异有统计学意义，实验重复至少 3 次。

关键结果

图1：早期与晚期 TNBC 肿瘤微环境单细胞图谱

该图展示了 TME 的细胞组成差异。A-B 为研究设计和临床样本信息;C-D 显示早期 TNBC 中 T 细胞、B 细胞富集，晚期 TNBC 中免疫细胞比例降低;E-F 通过 UMAP 聚类识别出主要细胞类型(肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞等);G 展示各细胞群的特征基因表达;核心发现是早期 TNBC 免疫激活通路(适应性免疫、抗原呈递、I 型 IFN 响应)上调，为后续 ISG⁺CD8⁺T 细胞的发现奠定基础。

图2：ISG⁺CD8⁺T 细胞是早期 TNBC 免疫治疗无响应的标志物

该图验证了 ISG⁺CD8⁺T 细胞的预测价值。A 显示早期 TNBC 中 ISG⁺CD8⁺T 细胞等亚群富集，且免疫治疗无响应者(NRs)中该细胞比例显著高于响应者(Rs);B-C 在本中心队列和 I-SPY2 外部队列中，ISG⁺CD8⁺T 细胞高表达者免疫治疗 pCR 率显著降低，化疗组无差异;D-F 通过 mIHC 验证，早期 TNBC 中 ISG⁺CD8⁺T 细胞高表达与免疫治疗无响应相关，而晚期 TNBC 中该细胞比例低且与疗效无关。

图3：ISG⁺CD8⁺T 细胞具有衰老表型和 NAD⁺代谢缺陷

该图揭示 ISG⁺CD8⁺T 细胞的功能特征。A-B 显示其衰老评分、IFN 响应评分升高，细胞毒性和耗竭评分降低;C 转录组分析显示 ISG 基因和衰老相关基因上调，细胞毒性、T 细胞活化相关基因下调;D-E 流式细胞术验证其高表达 ISG(IFIT3、PLSCR1)和衰老标志物(CD57、KLRG1)，低表达 GZMB;F-G 通过 KLRG1+PLSCR1 可有效分选 ISG⁺CD8⁺T 细胞;H-J 证实其端粒缩短、端粒酶活性降低、β- 半乳糖苷酶阳性率升高，存在衰老表型;K-M 显示其 NAD⁺/NADH 比值降低，PARP8/9/10/14 高表达导致 NAD⁺过度消耗。

图4：ISG⁺CD8⁺T 细胞细胞毒性受损且对 PD1 阻断无响应

该图验证 ISG⁺CD8⁺T 细胞的功能缺陷。A-B 体外共培养中，ISG⁺CD8⁺T 细胞组 PDO 活力更高，IFN-γ、TNF-α 浓度更低，抗 PD1 治疗无改善;C-D 小鼠肿瘤细胞共培养实验得到一致结果;E-J 体内过继性转移实验显示，转移 ISG⁺CD8⁺T 细胞的小鼠肿瘤体积更大，抗 PD1 治疗无法抑制肿瘤生长，且肿瘤中 GZMB⁺CD8⁺T 细胞比例降低;K-M depletion ISG⁺CD8⁺T 细胞可恢复抗 PD1 治疗效果。

图5：HLA-DR⁺单核细胞通过 IFN-IRF9-PARP 轴诱导 ISG⁺CD8⁺T 细胞衰老

该图阐明核心机制。A-CIFN 处理可诱导 CD8⁺T 细胞衰老，降低细胞毒性;D-EIFN 处理的 CD8⁺T 细胞与 PDO 共培养时，抗 PD1 治疗无响应;F-IIRF9 敲低可降低 ISG⁺CD8⁺T 细胞的衰老表型，上调细胞毒性基因;JChIP-qPCR 证实 IRF9 结合 PARP8/9/10/14 启动子;K-NHLA-DR⁺单核细胞高表达 I 型 IFN，且其 abundance 与 ISG⁺CD8⁺T 细胞正相关;O-THLA-DR⁺单核细胞可诱导 CD8⁺T 细胞衰老，中和 IFN 或 depletion MHC II⁺Ly6C⁺单核细胞可逆转该效应，降低 ISG⁺CD8⁺T 细胞比例并增强抗 PD1 疗效;U 提出机制模型：HLA-DR⁺单核细胞产生的 I 型 IFN 激活 IRF9，上调 PARP 表达，导致 CD8⁺T 细胞 NAD⁺耗竭、衰老和功能缺陷。

图6：NMN 恢复 ISG⁺CD8⁺T 细胞功能

该图验证 NMN 的干预效果。A-E NMN 预处理可升高 ISG⁺CD8⁺T 细胞的 NAD⁺/NADH 比值，改善衰老表型(端粒延长、衰老基因下调、β- 半乳糖苷酶阳性率降低);F-G 体外共培养中，NMN 预处理的 ISG⁺CD8⁺T 细胞可降低 PDO 活力，抗 PD1 治疗进一步增强效果;H-I 小鼠肿瘤细胞共培养实验得到一致结果;J-L 体内过继性转移实验显示，NMN 预处理的 ISG⁺CD8⁺T 细胞可抑制肿瘤生长，联合抗 PD1 治疗效果更显著;M-QNMN 预处理可抵抗 HLA-DR⁺单核细胞诱导的衰老，维持 CD8⁺T 细胞毒性。

图7：NMN 增强乳腺癌免疫治疗敏感性

该图验证 NMN 联合治疗的临床潜力。A-H 小鼠模型中，NMN 联合抗 PD1 治疗可显著降低肿瘤体积和重量，减少 ISG⁺CD8⁺T 细胞比例，升高 GZMB⁺CD8⁺T 细胞比例和 NAD⁺/NADH 比值;I-J 临床前瞻性队列中，NMN 联合抗 PD1 治疗可降低 PDO 活力，升高 IFN-γ、TNF-α 浓度;K-LISG⁺CD8⁺T 细胞高表达的样本对单纯抗 PD1 治疗响应差，而 NMN 的获益更显著，两者呈正相关。

全文总结

本研究在早期 TNBC 免疫治疗领域取得三大核心突破：一是发现 ISG⁺CD8⁺T 细胞是抗 PD1 治疗无响应的关键生物标志物，其富集程度可准确区分免疫治疗获益人群，解决了早期 TNBC 缺乏有效预测指标的难题;二是阐明了 “HLA-DR⁺单核细胞 - I 型 IFN-IRF9-PARP-NAD⁺耗竭” 的核心机制，揭示了干扰素诱导 T 细胞衰老的全新路径;三是提供了 NMN 联合抗 PD1 的治疗策略，通过恢复 NAD⁺代谢逆转 ISG⁺CD8⁺T 细胞衰老，显著增强免疫治疗效果，且在临床样本和动物模型中均得到验证。

该研究的临床转化价值显著：ISG⁺CD8⁺T 细胞可通过 mIHC 或 RNA-seq 快速检测，为早期 TNBC 患者的免疫治疗决策提供依据;NMN 作为安全的代谢调节剂，联合抗 PD1 治疗有望改善无响应患者的预后。未来需通过更大规模的前瞻性临床试验进一步验证该标志物和联合治疗策略的有效性，推动其进入临床应用。