MicroRNA-141通过EGFR/β-catenin信号通路诱导自噬调控肺缺血再灌注损伤

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：MicroRNA-141 regulates lung ischemia-reperfusion injury via EGFR/β-catenin signaling pathway to induce autophagy

中文标题：MicroRNA-141通过EGFR/β-catenin信号通路诱导自噬调控肺缺血再灌注损伤

发表期刊：《Aging-us》

影响因子：3.9

作者单位：

1.Department of Anesthesiology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, P.R. China

2.Department of Anesthesiology, Guizhou Province People's Hospital, Guiyang, P.R. China

作者信息：

第一作者：Miao Yang,Xiaomei Ling

通讯作者：Jinfang Xiao

研究背景

肺缺血再灌注损伤是肺移植后主要并发症之一，严重影响患者生存率。目前LIRI的具体机制尚不明确，缺乏有效防治手段。微小RNA作为内源性非编码RNA，可在转录后水平调控基因表达，参与多种器官IRI的病理过程。miR-141在心肌和神经细胞IRI中表达下调，但其在肺IRI中的作用未见报道。通过生物信息学预测，miR-141可能靶向表皮生长因子受体。EGFR参与细胞生长、分化、自噬和凋亡，且与β-catenin信号通路存在交叉调控。β-catenin也被报道在IRI中发挥保护作用。本研究旨在探讨miR-141是否通过调控EGFR/β-catenin信号通路影响自噬，从而参与LIRI的发生发展，为临床治疗提供新靶点。

研究方法

研究采用C57BL/6小鼠构建肺缺血再灌注损伤模型(左肺门夹闭30 min后再灌注120 min)，以及小鼠肺微血管内皮细胞构建缺氧/复氧模型(缺氧12 h，复氧4 h)。通过RT-qPCR检测miR-141、EGFR、β-catenin的mRNA水平;Western blot检测EGFR、β-catenin、自噬相关蛋白LC3II/I和BECN1的表达;TUNEL染色和流式细胞术检测细胞凋亡;HE染色评估肺组织损伤;LC3免疫荧光观察自噬体形成;血气分析测定PaO2/FiO2;湿干重比评估肺水肿。使用miR-141拮抗剂(antagomir)和siRNA敲低EGFR。双荧光素酶报告基因实验验证miR-141与EGFR 3‘UTR的直接结合。Pearson相关性分析各分子间关联。

实验结果

图 1：LIRI模型中miR-141表达上调

图1A-B显示，与假手术组相比，I/R模型小鼠左心室血PaO2/FiO2显著降低，肺组织湿干重比升高，提示肺功能受损和水肿。图1C的HE染色显示I/R组肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润、透明膜形成，肺损伤评分升高。图1D的TUNEL染色和图1E的流式细胞术显示，I/R组肺组织和PMVECs凋亡率显著增加。图1F-G的RT-qPCR显示，I/R肺组织和H/R处理的PMVECs中miR-141水平均显著上调。该图首次证明miR-141在LIRI体内外模型中高表达，与以往在心肌/神经IRI中的结果相反，提示miR-141的作用具有组织特异性。

图 2：敲低miR-141抑制自噬并减轻LIRI

图2A显示，I/R小鼠肺组织中miR-141水平升高，而腹腔注射miR-141拮抗剂可有效降低其表达。图2B的Western blot显示，I/R组LC3II/I比值和BECN1蛋白水平升高(自噬增强)，而miR-141拮抗剂可逆转这一变化。图2C-D显示，miR-141拮抗剂可提高I/R小鼠的PaO2/FiO2并降低肺湿干重比。图2E的HE染色和图2F的TUNEL染色显示，敲低miR-141可减轻肺组织损伤和细胞凋亡。图2G-J为PMVECs中一致的结果：miR-141拮抗剂降低miR-141水平，抑制自噬(LC3II/I、BECN1下降，LC3斑点减少)，降低凋亡率。这些结果证明miR-141通过促进自噬加剧LIRI。

图 3：miR-141通过负调控EGFR抑制β-catenin表达

图3A-B显示，I/R肺组织和H/R处理的PMVECs中EGFR和β-catenin的mRNA和蛋白水平均显著降低，与miR-141呈反向关系。图3C的TargetScan预测显示miR-141与EGFR 3‘UTR存在保守结合位点。图3D的双荧光素酶报告实验表明，miR-141 agomir可显著抑制野生型EGFR-3’UTR的荧光素酶活性，而对突变型无影响，证实直接靶向关系。图3E显示，转染miR-141拮抗剂可恢复H/R细胞中EGFR和β-catenin的表达。图3F筛选出高效的si-EGFR-3用于后续实验。图3G显示，在H/R细胞中，miR-141拮抗剂上调β-catenin的作用可被共转染si-EGFR完全消除。图3H的Pearson相关分析显示，在LIRI小鼠肺组织中，miR-141与EGFR、miR-141与β-catenin均呈负相关，而EGFR与β-catenin呈正相关。该图确立了miR-141→EGFR→β-catenin的调控轴。

图 4：miR-141/EGFR/β-catenin轴促进自噬加重H/R诱导的PMVECs损伤

图4A显示，H/R处理上调miR-141、下调EGFR;转染miR-141拮抗剂可逆转EGFR的下调;而共转染si-EGFR则部分抵消这种恢复。图4B的Western blot显示，H/R处理降低EGFR和β-catenin，升高LC3II/I和BECN1;miR-141拮抗剂可恢复EGFR/β-catenin并抑制自噬;但加入si-EGFR后，β-catenin再次下降，自噬再次增强。图4C的LC3免疫荧光显示，miR-141拮抗剂减少LC3斑点(自噬体)，而si-EGFR恢复斑点数量。图4D的流式细胞术显示，miR-141拮抗剂降低凋亡率，si-EGFR消除该保护作用。这些结果证明miR-141通过抑制EGFR/β-catenin轴促进自噬进而诱导细胞损伤。

图 5：体内验证miR-141/EGFR/β-catenin轴促进自噬加重LIRI

图5A显示，I/R小鼠肺组织中miR-141升高、EGFR降低;miR-141拮抗剂可降低miR-141并升高EGFR;而联合si-EGFR则部分抵消EGFR的升高。图5B的Western blot显示，I/R组EGFR和β-catenin下降，LC3II/I和BECN1升高;miR-141拮抗剂逆转这些变化，但联合si-EGFR消除逆转效果。图5C-D显示，miR-141拮抗剂改善PaO2/FiO2和湿干重比，si-EGFR削弱该改善。图5E的HE染色和图5F的TUNEL染色显示，miR-141拮抗剂减轻肺组织损伤和凋亡，si-EGFR则削弱保护作用。该图在整体动物水平上验证了miR-141通过抑制EGFR/β-catenin轴促进自噬加剧LIRI。

研究结论

本研究首次揭示miR-141在肺缺血再灌注损伤中表达显著上调，并通过直接靶向EGFR的3‘UTR抑制EGFR表达，进而下调β-catenin，促进自噬过度激活，加剧肺组织损伤和细胞凋亡。敲低miR-141或恢复EGFR/β-catenin信号可有效抑制自噬，改善肺功能，减轻病理损伤。该研究阐明了miR-141/EGFR/β-catenin/自噬信号轴在LIRI中的关键作用，为临床防治肺移植相关缺血再灌注损伤提供了新的分子靶点(miR-141抑制剂或EGFR激活剂)。同时，也提示miRNA在不同器官IRI中的作用可能截然相反，具有组织特异性。