肿瘤周围脂肪组织通过脂肪-间充质转化动结直肠癌免疫逃逸

基本信息

英文标题：Peritumoural adipose tissue drives immune evasion in colorectal cancer via adipose-mesenchymal transformation

中文标题：肿瘤周围脂肪组织通过脂肪-间充质转化驱动结直肠癌免疫逃逸

发表期刊：《Nature Cell Biology》

影响因子：19.1

作者单位：

中山大学肿瘤防治中心

中山大学等

作者信息：

Jin-Hong Wang, Yong-Qiang Zheng, Zheng-Yu Qian, Huai-Qiang Ju等

研究背景

研究背景：

1.临床/生物学问题：

结直肠癌(CRC)周围常存在大量内脏脂肪组织(tVAT)，但其在肿瘤免疫逃逸中的具体作用尚不明确。

2.现有研究的局限性：

多数研究聚焦于肿瘤内部的微环境(TME)，忽视了肿瘤周围脂肪组织对免疫系统的调控作用。

3.研究切入点与创新点：

本研究首次通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)系统描绘了tVAT的免疫图谱，揭示其通过CXCL12-CXCR4轴竞争性“截留”免疫细胞，促进肿瘤免疫逃逸，并提出“脂肪-间充质转化”(Adipose-Mesenchymal Transformation)这一新概念。

研究方法

1.动物模型构建：

使用C57BL/6J小鼠、BALB/c小鼠、NSG小鼠等，建立MC38、CT26、E0771等皮下及盲肠原位肿瘤模型。

2.细胞培养与处理：

使用MC38、CT26、E0771细胞系，以及小鼠脂肪来源干细胞(ASCs)，进行肿瘤条件培养基(CM)刺激、TGF-β1诱导分化等实验。

3.单细胞与单核RNA测序：

对tVAT、dVAT、肿瘤、正常组织进行scRNA-seq和snRNA-seq，分析细胞亚群、轨迹发育、TCR/BCR克隆性。

4.免疫组化与多重免疫荧光：

使用mIHC、IF、H&E染色验证TLS结构、adCAF标志物(FAP、PDGFRB、MDK)及免疫细胞浸润。

5.功能性实验：

细胞趋化实验(3D Chemotaxis Assay)

T细胞共培养与激活实验

流式细胞术检测免疫细胞亚群及CXCR4表达

ELISA检测CXCL12、TGF-β1分泌

基因敲除与细胞清除模型：

Cxcl12条件性敲除小鼠(Cxcl12fl/fl)

Mdk-DTR小鼠特异性清除adCAF

ATS-GNP纳米颗粒特异性消除脂肪组织

6.临床样本分析：

纳入67例局部晚期CRC患者，评估tVAT面积与免疫治疗响应之间的相关性。

实验结果

图1 | 单细胞RNA图谱揭示了tVAT的组织特异性免疫景观。

a. 实验设计示意图，展示了从结直肠癌(CRC)患者身上采集肿瘤、肿瘤周围内脏脂肪组织(tVAT)和远端内脏脂肪组织(dVAT)进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析的流程(使用BioRender.com绘制)。

b. 综合UMAP图，展示了70个肿瘤样本、12个正常样本、12个tVAT样本和12个dVAT样本中总共371,381个高质量单细胞的转录图谱，并根据经典标记基因鉴定出13种不同的细胞亚群。

c. 热图显示了四种组织类型(tVAT、dVAT、肿瘤、正常)中主要细胞亚群的相对比例。

d. 使用Milo方法进行差异丰度分析，识别出tVAT(n=12)和dVAT(n=12)之间细胞邻域(Nhoods)的差异。节点大小与每个Nhood中的细胞数量成正比，图边表示相邻Nhood之间共享的细胞数量。显示为白色的节点表示差异不显著(假发现率 ≥ 0.1)。

e. Beeswarm图展示了tVAT(n=12)和dVAT(n=12)之间所有细胞类型的Nhoods丰度调整后的对数2倍变化(log2 FC)分布。

f. 箱线图比较了tVAT(n=12)和dVAT(n=12)中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞和基质细胞的相对丰度(使用双侧配对Wilcoxon检验)。箱线从下到上表示第一四分位数、中位数、第三四分位数，须线表示全距。

g. CRC患者dVAT和tVAT切片中三级淋巴结构(TLSs)的代表性苏木精-伊红(H&E)染色(23个样本)和多重免疫组化(mIHC)染色(4个样本)图像。比例尺，200 μm。

图2 | tVAT与dVAT中淋巴细胞的特性比较。

a. UMAP图展示了CD4+ T细胞、CD8+ T细胞/自然杀伤(NK)细胞和B/浆细胞的转录异质性及其亚群。

b. 热图显示了不同淋巴细胞亚群在tVAT、dVAT、肿瘤和正常组织中的组织分布偏好。

c. Beeswarm图展示了tVAT(n=12)和dVAT(n=12)之间淋巴细胞亚群的差异丰度。

d. 单个患者的dVAT、肿瘤和tVAT中前20个扩增最多的T细胞受体(TCR)克隆型的纵向追踪。每个色带代表一个独特的TCR克隆型，列之间的彩色条带表示不同组织间共享的克隆型。

e. 箱线图比较了tVAT(n=3)和dVAT(n=3)中TCR克隆多样性的差异(使用双侧配对Student's t检验)。

f. 热图显示了各组织样本间及其与对应肿瘤之间B细胞受体(BCR)克隆型的重叠情况。

g. 箱线图比较了tVAT(n=3)和dVAT(n=3)与各自肿瘤之间的BCR克隆型重叠度(使用双侧配对Student's t检验)。

图3 | tVAT与肿瘤组织竞争浸润性淋巴细胞。

a. MC38-OVA荷瘤C57BL/6J小鼠(每组n=5)在假手术、对照组或PAT切除后的代表性肿瘤图像(左)和肿瘤生长曲线(右)。

b. CT26荷瘤BALB/c小鼠(每组n=5)在假手术、对照组或PAT切除后的代表性肿瘤图像(左)和肿瘤生长曲线(右)。

c. 特异性减少PAT的ATS-GNP纳米颗粒(含CaCO3核和PLG壳，偶联ATS肽)的作用机制示意图。

d. C57BL/6J、BALB/c-Nude和NSG小鼠中MC38肿瘤在假手术或PAT切除后的生长曲线(每组n=5)。

e. C57BL/6J小鼠中E0771肿瘤在假手术、对照(切除对侧脂肪)或PAT切除后第16天的代表性图像(每组n=5)。

f. C57BL/6J小鼠中E0771肿瘤在假手术、对照或PAT切除后第16天的肿瘤重量(每组n=5)。

g. MC38-OVA肿瘤中活细胞门控的CD45+细胞代表性流式细胞术图。

h. 小提琴图展示了CRC患者所有细胞类型中CXCR7的表达水平(使用Kruskal-Wallis检验)。

i. 构建Cxcl12条件性敲除(cKO)小鼠的编辑策略。

j. 在PAT附近构建对照和Cxcl12fl/fl cKO小鼠MC38-OVA肿瘤的实验设计。

k. 蛋白质印迹(Western blot)验证对照和Cxcl12fl/fl cKO小鼠PAT中Cxcl12的敲除效率。

l. RT-qPCR验证对照和Cxcl12fl/fl cKO小鼠(n=6)的肝脏、脾脏、子宫和肿瘤组织中的Cxcl12敲除效率。

图4 | CXCL12-CXCR4信号轴介导tVAT中淋巴细胞的保留。

a. 基于配体-受体对(前六对)分析tVAT中基质细胞与淋巴细胞之间的细胞间通讯(左)，并比较tVAT、dVAT和肿瘤中的通讯概率(右)。

b. 标记图显示了tVAT、dVAT和肿瘤中CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、B细胞、浆细胞与基质细胞群之间显著的CXCL12-CXCR4相互作用。线条宽度代表通讯概率。

c. 小提琴图展示了CRC患者所有细胞类型中CXCL12(上)和CXCR4(下)的表达水平。

d. 小提琴图比较了CRC患者dVAT与tVAT(上)以及肿瘤与tVAT(下)中CXCL12的表达水平(使用双侧Wilcoxon检验)。

e. PAT C57BL/6J小鼠模型中，使用IgG或抗CXCL12抗体治疗(左)的实验设计，以及第16天实验结束时的代表性MC38肿瘤图像(右)(每组n=5)。

f. C57BL/6J小鼠(n=5)中MC38肿瘤在实验第16天的肿瘤生长曲线(左)和肿瘤重量(右)。

g. 对照和Cxcl12fl/fl cKO小鼠(n=6)中MC38肿瘤的代表性图像(左)和肿瘤生长曲线(右)。

h. 对照和Cxcl12fl/fl cKO小鼠(n=6)在实验第16天的MC38肿瘤重量。

i. 流式细胞术分析对照和Cxcl12fl/fl cKO小鼠(n=6)MC38肿瘤中不同CXCR4+免疫细胞的浸润数量。

j. 使用T细胞作为“传感器”、条件培养基作为“汇”的趋化实验示意图(左)，以及对照或CXCL12诱导的T细胞迁移1小时的轨迹图(右)。

k. 通过流式细胞术定量分析，在有或没有PAT切除(或切除对侧腹股沟脂肪作为对照)的情况下，MC38肿瘤中CXCR4+ CD45.1+ T细胞的绝对数量(每组n=5)。

图5 | 肿瘤在tVAT中诱导脂肪-间充质转化。

a. CRC患者tVAT、dVAT、肿瘤和正常组织中所有基质细胞的UMAP图，根据推断的细胞类型标记了10个聚类(ASCs、pACs、CAFs、周细胞PCs、间皮细胞Mesos)。

b. 热图展示了八种基质细胞亚型在不同组织类型中的分布。

c. CRC患者tVAT和dVAT中八种VAT相关基质细胞亚型的UMAP图，包括ASC、pAC和adCAF。

d. Beeswarm图展示了tVAT和dVAT之间VAT相关基质细胞类型在Nhoods中的分布和丰度。

e. 堆叠柱状图展示了八种VAT相关基质细胞亚型在dVAT和tVAT中的丰度。

f. 热图显示了VAT相关基质细胞类型中多种标记基因的RNA表达，包括ASC/pAC标记、CAF标记、细胞因子和基质标记。

g. CRC患者tVAT样本中adCAF存在的代表性多重免疫荧光图像。比例尺，10 μm。DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)用于染核。

h. 小鼠异种移植模型PAT中，富集adCAF的基质细胞(n=4)和非adCAF基质细胞(n=4)中多种细胞因子和促肿瘤因子的相对表达水平。数据以箱线图呈现(箱线边界为第一至第三四分位数，底部和顶部须线为最小至最大值，中心线为中位数)。

i. 基于配体-受体对(前六对)分析tVAT中adCAF与淋巴细胞之间的细胞间通讯(左)，以及tVAT与dVAT之间的比较(右)。

j. RT-qPCR(左)和ELISA(右)检测小鼠PAT中分选的富集adCAF的基质细胞和非adCAF基质细胞中CXCL12的RNA表达和蛋白分泌水平。

图6 | 肿瘤来源的因子诱导ASC分化为adCAF。

a. Monocle3推断的ASC来源的pAC和ASC来源的adCAF的细胞轨迹(上)和细胞丰度(下)，展示了dVAT(左)和tVAT(右)中的细胞轨迹。伪时间颜色代码如右框所示。

b. Monocle3伪时间分析显示，多个标记基因在dVAT(左)和tVAT(右)中随时间的动态表达变化。

c. Monocle2推断的ASC来源的pAC和ASC来源的adCAF的伪时间分析(上)和细胞轨迹(下)。伪时间颜色代码如右框所示。

d. Monocle2推断的ASC来源的pAC和ASC来源的adCAF在dVAT(上)和tVAT(下)中的细胞轨迹。

e. Monocle2伪时间分析显示pAC标记物(左)和adCAF标记物(右)随时间的动态表达变化。

f. 点图显示了ASC、pAC和adCAF中推断的差异转录因子(TF)活性。

g. 热图显示了ASC、pAC和adCAF中转录因子推断活性和RNA表达水平的动态变化。

h. 使用MC38肿瘤来源的条件培养基(CM)处理72小时后，小鼠ASC(mASC)形态的代表性图像。比例尺，100 μm。

i. RT-qPCR检测CM处理的mASC中adCAF相关基因(上)和转录因子(下)的RNA表达水平。

j. KEGG通路富集分析条形图，显示肿瘤CM处理的mASC中显著富集的信号通路。

k. KEGG通路富集分析条形图，显示富集adCAF的基质细胞与非adCAF基质细胞之间差异富集的信号通路。

图7 | 肿瘤-脂肪组织相互作用的临床意义。

a. 在PAT中使用Mdk-DTR系统特异性清除adCAF并结合抗PD-1治疗的实验设计(每组n=6)b. 实验结束时(第16天)，来自对照组(同窝对照)、抗PD-1单药组、Mdk-DTR(DT处理)组和联合治疗组的代表性MC38-OVA肿瘤图像。

c. (左图)各组小鼠的个体肿瘤生长曲线和(右图)肿瘤重量比较(每组n=6)。

d. 流式细胞术分析各组MC38-OVA肿瘤中免疫细胞(T细胞、CD4+ T、CD8+ T、肿瘤特异性CD8+ T)和CXCR4+免疫细胞亚群的浸润绝对数量(每组n=6)。

e. 接受新辅助免疫-放化疗的pMMR局部晚期CRC患者的治疗反应评估流程图。

f. 箱线图比较达到完全缓解(CR)和未达到完全缓解(非CR)患者的治疗前PAT面积(n=67)。数据以箱线图呈现(箱线边界为第一至第三四分位数，底部和顶部须线为最小至最大值，中心线为中位数)。

g. 箱线图分别比较T3期和T4期患者中CR与非CR组的tVAT面积差异。

h. ROC曲线分析，比较治疗前PAT面积与传统指标(CPS、TPS、CEA、CA199)对pMMR CRC患者免疫-放化疗反应的预测能力(n=67)，并显示最佳截断值。

i. 根据最佳截断值，比较tVAT高组和低组之间的病理完全缓解(pCR)率。

j. 图形摘要，描绘了肿瘤如何重塑tVAT中的基质环境，以及tVAT如何通过与肿瘤竞争免疫细胞来促进免疫逃逸的模型(使用BioRender.com绘制)。

研究结论

本研究首次系统揭示了结直肠癌周围脂肪组织(tVAT)通过“脂肪-间充质转化”形成adCAF，分泌CXCL12，竞争性截留CD8+ T细胞，促进免疫逃逸。靶向CXCL12-CXCR4轴或清除adCAF可显著增强抗PD-1治疗疗效。此外，tVAT面积可作为预测免疫治疗响应的临床生物标志物。

文献意义:

1.首次提出“脂肪-间充质转化”概念，揭示tVAT在肿瘤免疫调控中的新机制。

2.明确adCAF为CXCL12的主要来源，拓展了CAF的功能认知。

3.提供tVAT作为免疫治疗靶点及影像学生物标志物的临床证据。

4.为结直肠癌及其他腹部肿瘤的免疫治疗增敏提供了新策略。