基于新型G系列腔肠素变体的NanoLuc驱动多重成像平台

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

实验结果

图 1：G系列CTZ类似物对NanoLuc或ALuc16具有特异性

合成了20种G系列类似物，分为5类。发光强度测试显示，G6、G20等对NanoLuc具有极高的特异性，而G1则特异性识别ALuc16。部分类似物表现出中等到高的自发光(AL)。分子对接表明，C-8位氟苯基的间位氟取代有利于与NanoLuc结合，而C-2位对位氟取代同样增强结合。

图 2：G系列底物在活细胞中表现出快速发光和荧光素酶特异性

在COS-7细胞中，G16和G20与NanoLuc反应在2分钟内达到峰值，强度约为传统底物FMZ的2-3倍，但随后快速下降;FMZ则保持稳定。G1与ALuc16反应同样呈现高亮度峰值，且持续性较好。通过700 nm带通滤光片，可显著偏倚采集红移信号。G1的亲脂性(logP=3.81)最接近细胞膜穿透最优范围，解释了其能有效到达内质网定位的ALuc16。

图 3：G系列底物与不同荧光素酶反应呈现红移光谱

NanoLuc与G系列底物反应主要发射蓝光(λmax 457–505 nm)，而ALuc16与Category 1-2底物反应发射绿光(λmax 493–535 nm)。R86SG与G6、G8反应出现显著红移(λmax 567–570 nm)，其中G20-R86SG对达到589 nm，为最长波长。超过600 nm的光谱占比(P600)从G1的3.6%提升至G8的15.5%，有利于深部组织成像。

图 4：G1、G6、G20与NanoLuc和ALuc16的酶动力学分析

G1对ALuc16的Km为7.16 μM，对NanoLuc为0.69 μM，但Vmax(反映kcat)在ALuc16中高出8倍，解释了其亮度特异性。G6和G20对NanoLuc的催化效率分别比ALuc16高23倍和131倍，确认了它们对NanoLuc的高选择性。

图 5：基于NanoLuc和G6底物的单链BRET探针特异性检测雌激素拮抗剂

构建了不同连接子长度的单链探针(N2C2–N8C8)，其中N8C8在雌激素拮抗剂OHT和genistein刺激下BRET信号增强约1.8–2.2倍，而激动剂E2和DHT作用微弱。使用G6底物时信号显著，而传统CTZh底物因发射波长过短无法有效激活CyOFP1，证明G6适合此类BRET检测。

图 6：G1和G20在活体小鼠中实现特异性多重肿瘤成像

小鼠左侧接种表达NanoLuc的肿瘤，右侧接种表达ALuc16的肿瘤。注射G1后仅右侧肿瘤(ALuc16)发光，信号对比度高达1624倍;注射G20后仅左侧肿瘤(NanoLuc)发光，对比度达1367倍。离体成像确认信号仅来源于靶向肿瘤，无组织间串扰。

研究结论

本研究系统合成并表征了20种G系列腔肠素类似物，揭示了C-2位官能团决定荧光素酶选择性(亲水性羟基→ALuc16偏好;疏水性氟苄基→NanoLuc偏好)，C-8位氟原子位置影响化学稳定性。G系列底物与不同荧光素酶配对可产生从蓝光到橙红光的宽谱发射(最大589 nm)，显著提高组织穿透性和光谱分辨能力。通过单链BRET探针成功检测了雌激素拮抗剂的非基因组活性，并在活体小鼠中实现了超过1300倍信号对比度的多重肿瘤成像。该G系列底物平台为多色生物发光成像和深部组织监测提供了可调谐的解决方案。