萤火虫荧光素酶会“惹怒”免疫系统？CBG才是肿瘤免疫研究的好搭档

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：Immune Response to Bioluminescence Imaging Reporters in Murine Tumor Models

中文标题：小鼠肿瘤模型中生物发光成像报告基因的免疫反应研究

发表期刊：《Molecular Imaging and Biology》

影响因子：2.5

作者单位：

1.Department of Radiology, West Virginia University School of Medicine, Morgantown, WV, USA

2.Department of Microbiology, Immunology and Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, Morgantown, WV, USA

3.WVU Cancer Institute, West Virginia University, Morgantown, WV, USA

作者信息：

第一作者：Angisha Basnet

通讯作者：Tracy W. Liu

研究背景

生物发光成像(BLI)广泛用于实时监测肿瘤负荷和转移。随着肿瘤免疫学研究的深入，在免疫功能正常小鼠模型中使用报告基因时，必须确保报告基因本身不引发免疫反应，否则会改变肿瘤生长和肿瘤-免疫相互作用。萤火虫荧光素酶(FLuc)和点击甲虫绿色荧光素酶(CBG)是常用的BLI报告基因，但它们的免疫原性尚缺乏系统比较。本研究评估了红移萤火虫荧光素酶(RLuc)和CBG在四种不同肿瘤细胞系中的免疫原性，发现RLuc可诱导T细胞活化和肿瘤排斥，而CBG免疫原性极低，不干扰肿瘤生长和免疫微环境。

研究方法

构建稳定表达RLuc-GFP或CBG-GFP双报告基因的小鼠胰腺癌(KPCY6419、KPCY6422)和黑色素瘤(YUMM1.7、YUMM3.3、B16F10)细胞系。体外比较亲本和报告基因细胞的增殖曲线(台盼蓝计数)，并检测生物发光信号与细胞数的相关性。体内皮下或原位接种至免疫正常C57BL/6小鼠，测量肿瘤体积并定期活体成像。收集肿瘤终点组织，通过流式细胞术分析免疫细胞组成(CD4+、CD8+ T细胞、NK细胞、单核细胞等);收集脾脏细胞分析T细胞活化标志物(CD25、Granzyme B)和细胞因子(IFNγ、TNFα)分泌。同时检测细胞培养上清中多种细胞因子(KC、LIX、MCP-1、IP-10、RANTES等)的浓度。利用多种成像方式(2D BLI、3D CT、皮肤窗口腔活体共聚焦)展示CBG-GFP的应用潜力。

实验结果

图 1：表达RLuc-GFP的肿瘤细胞在免疫功能正常小鼠中无法成瘤

KPCY6419和KPCY6422细胞稳定表达RLuc-GFP后，体外增殖与亲本细胞无差异(图1a-b)，生物发光信号阳性(图1c)。但皮下接种至C57BL/6小鼠后，两种RLuc-GFP细胞均未形成可触及的肿瘤(图1d-e)。KPCY6419 RLuc-GFP细胞上清中KC、LIX、MCP-1显著升高(图1f)，而KPCY6422 RLuc-GFP无此变化(图1g)，说明细胞因子改变并非肿瘤排斥的唯一原因。

图 2：CBG-GFP报告基因不影响肿瘤细胞体外增殖

KPCY6419、KPCY6422、YUMM1.7、YUMM3.3细胞稳定表达CBG-GFP后，体外增殖曲线与亲本细胞相似(图2a-d)，且生物发光信号与细胞数呈良好线性关系(图2e及补充图S2)。表明CBG-GFP整合不影响细胞基本生长特性。

图 3：CBG-GFP报告基因不改变体内肿瘤生长

皮下接种CBG-GFP标记的KPCY6419、KPCY6422、YUMM1.7、YUMM3.3细胞后，肿瘤体积生长曲线与亲本细胞无显著差异(图3a-d)。活体生物发光成像可有效追踪肿瘤负荷随时间增加(图3e及补充图S3)。B16F10 CBG-GFP同样显示一致结果(补充图S4a-b)。表明CBG-GFP在多种肿瘤模型中均不引起肿瘤排斥。

图 4：CBG-GFP表达对细胞因子谱有细胞系特异性影响，但无统一规律

KPCY6419 CBG-GFP细胞中KC和LIX下降(图4a-b);KPCY6422 CBG-GFP中KC上升(图4c-d);YUMM1.7 CBG-GFP中IP-10、MCP-1、RANTES上升(图4e-f);YUMM3.3无显著变化(图4g)。这些细胞因子变化幅度不一，且未在体内对应免疫细胞浸润的改变，提示单独细胞因子分析不足以预测免疫原性。

图 5：CBG-GFP对肿瘤免疫细胞组成影响甚微，而RLuc-GFP诱导T细胞活化

终点肿瘤流式分析显示，除KPCY6419 CBG-GFP肿瘤中CD4+ T细胞比例略有升高(绝对值仍很低，图5a)外，其余细胞系均未见显著免疫细胞组成改变(图5b-d)。在接种RLuc-GFP细胞24小时后的小鼠脾脏中，活化的CD8+CD25+、CD8+Granzyme B+以及CD4+CD25+ T细胞比例显著升高(图5e-f)，而CBG-GFP组与亲本组无差异。说明RLuc通过激活T细胞导致肿瘤排斥。

图 6：CBG-GFP报告基因的多模态成像应用展示

原位胰腺癌模型中，CBG生物发光与3D CT成像可精确定位肿瘤(图6a)。黑色素瘤自发转移模型中，BLI可实时追踪肺和骨转移(图6b)。皮肤窗口腔模型中，宏观及共聚焦成像可同时检测CBG生物发光和GFP荧光，展示肿瘤-微环境相互作用(图6c-d)。证实CBG-GFP适用于多种成像模态。

研究结论

本研究系统比较了两种生物发光报告基因(红移萤火虫荧光素酶RLuc和点击甲虫绿色荧光素酶CBG)在免疫功能正常小鼠肿瘤模型中的免疫原性。结果表明，RLuc-GFP表达可诱导强烈的适应性免疫反应(CD8+ T细胞活化和细胞毒性增强)，导致肿瘤在体内完全被排斥，无法用于免疫正常小鼠的肿瘤学研究。而CBG-GFP报告基因在胰腺癌和黑色素瘤多种细胞系中均不改变体外增殖和体内肿瘤生长速率，对肿瘤免疫微环境组成影响极小，且支持多模态成像(BLI、CT、荧光显微镜)。因此，CBG-GFP是用于免疫功能正常小鼠肿瘤免疫研究的理想生物发光报告基因。研究强调，在建立报告基因肿瘤细胞系时，必须验证其免疫原性，不能仅依赖体外增殖和细胞因子数据。