宿主因子DDB2和DNA聚合酶δ与乙型肝炎病毒及隐匿性乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中cccDNA的持续存在相关

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Host Factors DDB2 and DNA Polymerase Delta Are Linked to cccDNA Persistence in Hepatitis B Virus and Occult Hepatitis B Virus-Related Hepatocellular Carcinoma

中文标题：宿主因子DDB2和DNA聚合酶δ与乙型肝炎病毒及隐匿性乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中cccDNA的持续存在相关

发表期刊：《Journal of Viral Hepatitis》

影响因子：2.3

作者单位：

1.Center of Excellence in Kidney-Liver-Microbiota, Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand

2.Department of Surgery, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, King Chulalongkorn Memorial Hospital, Bangkok, Thailand

3.Center of Excellence in Hepatitis and Liver Cancer, Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand

4.Department of Gastroenterology and Hepatology, Faculty of Life Sciences, Kumamoto University, Kumamoto, Japan

作者信息：

第一作者：Kanyakorn Singsung

通讯作者：Natthaya Chuaypen, Pongserath Sirichindakul

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是导致肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要原因。HBV的共价闭合环状DNA(cccDNA)是病毒在肝细胞核内形成的稳定游离型基因组，作为所有病毒RNA和蛋白的转录模板，是病毒持续存在和难以根治的关键因素。当前抗病毒治疗无法清除cccDNA。宿主DNA修复因子如DDB2和DNA聚合酶δ(Pol δ)在体外被证实参与cccDNA的生成与维持，但缺乏临床组织样本的验证。隐匿性HBV感染(OBI)定义为血清HBsAg阴性但肝内存在cccDNA，其病毒转录活性通常极低，但仍可导致HCC。本研究旨在利用HBV感染的HepG2-NTCP细胞模型及HBV-HCC和OBI-HCC患者的肝组织，验证DDB2和Pol δ在cccDNA持续存在中的作用。

研究方法

本研究分为细胞实验和临床样本验证两部分。细胞实验使用HBV感染的HepG2-NTCP细胞，通过siRNA敲低DDB2或Pol δ，采用Western blot验证敲低效率，利用qPCR定量总HBV DNA，并通过微滴式数字PCR(ddPCR)检测cccDNA。临床部分纳入23例HBV-HCC和21例OBI-HCC患者，收集非肿瘤肝组织，采用酚-氯仿法提取DNA，经Plasmid-Safe DN酶处理富集cccDNA后以ddPCR定量;总HBV DNA以qPCR检测;血清HBcrAg采用高灵敏iTACT-HBcrAg化学发光法检测;肝组织中DDB2和Pol δ蛋白表达通过Western blot和ImageJ灰度分析进行定量。相关性分析使用Spearman秩相关系数。

实验结果

图 1：siRNA有效敲低HepG2-NTCP-HBV细胞中DDB2和Pol δ的表达

Western blot显示，与scramble对照组相比，DDB2和Pol δ的蛋白表达分别降至0.43倍(p=0.001)和0.42倍(p<0.0001)，确认了高效的敲低效率，为后续功能研究奠定了基础。

图 2：敲低DDB2和Pol δ显著降低细胞内总HBV DNA和cccDNA水平

qPCR结果显示，敲低DDB2或Pol δ后，细胞内HBV DNA(拷贝/细胞)均显著下降(p=0.022和p=0.023)。ddPCR定量显示，cccDNA(拷贝/反应)也显著降低(p=0.010和p=0.006)。表明这两个宿主因子对维持cccDNA库和病毒复制至关重要。

图 3：DDB2和Pol δ在HBV-HCC和OBI-HCC肝组织中的表达无显著差异

DDB2在HBV-HCC中100%可检出，在OBI-HCC中90.48%可检出，组间表达无统计学差异(p=0.116)。Pol δ在HBV-HCC中仅26.09%可检出，在OBI-HCC中80.95%可检出，但总体表达水平也无显著差异(p=0.474)。

图 4：OBI-HCC患者肝内病毒标志物显著低于HBV-HCC

HBV-HCC肝内总HBV DNA中位数为0.28 copies/cell，OBI-HCC仅为0.06 copies/cell(p<0.0001)。cccDNA中位数分别为4.8和1.2 copies/reaction(p<0.0001)。血清HBcrAg可检出率分别为91.3%和23.8%(p<0.001)。表明OBI中病毒库虽存但活性极低。

图 5：DDB2表达与肝内HBV DNA和cccDNA在两组中均正相关，但与HBcrAg仅在HBV-HCC中相关

在HBV-HCC中，DDB2表达与肝内HBV DNA(r=0.885)、cccDNA(r=0.725)及血清HBcrAg(r=0.750)均强正相关(均p<0.001)。在OBI-HCC中，DDB2仍与HBV DNA(r=0.712，p<0.001)和cccDNA(r=0.595，p=0.007)显著相关，但与HBcrAg无显著相关性(r=0.633，p=0.500)，可能因OBI中可检出HBcrAg的样本数有限(仅4例)。

研究结论

本研究首次整合细胞模型和临床肝组织样本，证实宿主DNA修复因子DDB2和DNA聚合酶δ在HBV cccDNA的生成与持续存在中发挥关键作用。在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中敲低这两个因子可显著降低cccDNA和总HBV DNA水平。在HBV-HCC和OBI-HCC患者的肝组织中，尽管OBI组肝内病毒载量和cccDNA转录活性(以血清HBcrAg反映)显著低于HBV-HCC组，但DDB2和Pol δ的表达水平两组间无显著差异。DDB2表达与肝内cccDNA和HBV DNA在两组中均呈正相关，提示DDB2参与cccDNA的物理维持而非转录调控。Pol δ在OBI-HCC中检出率更高，可能反映不同感染状态下宿主修复通路的差异使用。研究为靶向DDB2或Pol δ以清除或沉默cccDNA提供了理论基础，有望推动HBV功能性治愈策略的发展。