表达颗粒酶 K（GZMK）的 CD8⁺T 细胞通过激活补体级联反应促进复发性气道炎症疾病

研究背景

慢性鼻窦炎、哮喘等气道炎症疾病常慢性复发，现有治疗难以根除根本病因。鼻息肉作为慢性鼻窦炎的严重表现形式，复发率高且需反复手术，但驱动其复发的特异性 T 细胞亚群及机制尚未明确。此前研究已知 T 细胞浸润在鼻息肉组织中，但具体哪类 T 细胞亚群主导疾病进展和复发，以及其作用机制仍缺乏深入解析，本研究填补了这一空白。

本期文献发表于《Nature》期刊，文章标题为GZMK-expressing CD8⁺T cells promote recurrent airway inflammatory diseases(表达颗粒酶 K 的 CD8⁺T 细胞促进复发性气道炎症疾病)，作者是来自首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻喉头颈外科、北京市鼻病重点实验室;清华大学免疫学研究所动态免疫生物学实验室;清华大学医学院基础医学系的Feng Lan、Jizhou Li等。

该研究通过分析复发性鼻息肉患者的 T 细胞受体库和单细胞转录组，发现表达颗粒酶 K(GZMK)的 CD8⁺T 细胞克隆可在疾病复发时持续定植于黏膜组织，其通过切割补体成分(C2、C3、C4、C5)激活补体级联反应;组织 GZMK 水平对疾病严重程度和合并症的预测价值优于嗜酸性粒细胞增多和 IL-5 等传统标志物;在小鼠哮喘模型中，敲除或药物抑制 GZMK 可显著减轻组织病理损伤并恢复肺功能，证实 GZMK 是复发性气道炎症的关键驱动因子和潜在治疗靶点。

实验方法

1.临床样本与队列构建：

样本来源：206 例受试者(172 例鼻息肉患者、34 例鼻中隔偏曲患者作为健康对照)，其中 6 例鼻息肉患者提供两次手术的配对样本，148 例患者(21 例对照、62 例鼻息肉、65 例严重鼻息肉)用于验证;建立 87 例早期乳腺癌前瞻性队列用于临床验证。

检测手段：对 7 例鼻息肉和 4 例对照样本进行单细胞 RNA 测序(scRNA-seq)，对配对样本进行 T 细胞受体(TCR)库测序，对 153 例鼻息肉和 44 例晚期样本进行多重免疫组化(mIHC)，激光捕获显微切割结合 bulk RNA-seq 分析 GZMK⁺细胞聚集区的基因表达。

2.细胞分离与培养：

分离鼻息肉组织中的 CD8⁺T 细胞(分 GZMK⁺和 GZMK⁻亚群)、HLA-DR⁺单核细胞等，采用含 10% FBS 的 RPMI 培养基培养;通过胶原酶和 DNase I 消化组织制备单细胞悬液。

重组蛋白表达：在 293-F 细胞中表达野生型人 GZMK 和无活性突变体(GZMK-S214A)，经镍亲和层析和阳离子交换层析纯化。

3.功能验证实验：

体外实验：GZMK 底物筛选(免疫沉淀结合质谱分析)、补体切割实验(Western blot、Edman 测序验证切割位点)、THP1 细胞 ERK 磷酸化检测验证 C3a 活性、溶血实验检测膜攻击复合物活性。

体内动物模型：采用卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠哮喘模型，通过 CD4-cre;Gzmkfl/fl 条件敲除小鼠、GZMK 过表达 OT-I 细胞过继转移、GZMK 抑制剂(PPACK)干预等实验，评估气道炎症程度和肺功能。

4.表型与机制验证：

表型鉴定：流式细胞术检测 GZMK⁺CD8⁺T 细胞的表面标志物(KLRG1、CD27、ITGAE)、功能分子(GZMB、CD57);β- 半乳糖苷酶染色、端粒长度和端粒酶活性检测验证细胞衰老特征。

调控关系：通过 GLIPH2 算法预测 TCR 抗原特异性，CellPhoneDB 分析细胞间相互作用，验证 GZMK⁺CD8⁺T 细胞与辅助性 T 细胞、髓系细胞的 Crosstalk。

5.GZMK 干预实验：

基因敲除：Rosa26-CreERT2;Gzmkfl/fl 小鼠经他莫昔芬诱导 GZMK 敲除，评估疾病不同阶段敲除对炎症的影响。

药物抑制：在小鼠哮喘模型中，腹腔注射 GZMK 抑制剂 PPACK 或 GZMB 抑制剂 Z-IETD-FMK，对比分析气道炎症指标和肺功能改善情况。

6.统计分析：

采用 Mann-Whitney U 检验(人类数据)、双侧 Student’s t 检验(小鼠数据)、Chi-square 检验(分类变量)、ROC 曲线分析(标志物预测价值);P<0.05 为差异有统计学意义，实验重复至少 2-4 次。

关键结果

图1：复发性鼻息肉中存在持续的 T 细胞克隆

该图揭示疾病复发时的 T 细胞克隆特征。A-B 为研究设计和样本信息;C 通过 TCRβ 测序证实，同一患者两次手术的鼻息肉组织中存在共同 T 细胞克隆，且部分为优势克隆;D-E 通过 UMAP 聚类识别出 15 个 αβT 细胞亚群，展示各亚群在不同个体中的分布;F-G 显示持续 T 细胞克隆主要归属于 CD8⁺T 细胞亚群(T0、T1)，证实复发性鼻息肉中存在可长期存活的 T 细胞克隆。

图2：CD8⁺T 细胞亚群与疾病严重程度相关

该图明确 GZMK⁺CD8⁺T 细胞的表型和临床关联。A 显示 T0 亚群为组织驻留记忆 T 细胞(表达 ITGAE、CD69)，T1 亚群为效应记忆样 T 细胞(表达 KLRG1、CD27);B-C 流式验证显示，严重鼻息肉患者中 T1 亚群(KLRG1⁺CD27⁺ITGAE⁺)比例显著升高;D-E 通过外周血 CD8⁺T 细胞测序，发现组织 T1 细胞与血液 B2 亚群同源;F-G 证实血液与组织中存在共享 T 细胞克隆，且 B2 亚群与 T1 细胞转录组高度相似，提示血液 T 细胞可能向组织迁移并分化为致病性 T1 细胞。

图3：GZMK 是 T1 亚群的特征效应分子且可预测疾病严重程度

该图验证 GZMK 的表达特征和临床价值。A-B 显示 T1 亚群不表达 2 型细胞因子，但高表达 GZMK;C 流式证实 GZMK 在 T1 亚群(KLRG1⁺CD27⁺ITGAE⁺/⁻)中高表达，NK 细胞中少量表达;D-E ELISA 和 ROC 曲线显示，组织 GZMK 水平在严重鼻息肉中显著升高，其预测疾病严重程度的 AUC 值(0.667)优于 IL-5(0.556)和嗜酸性粒细胞计数(0.504);F-G 显示 GZMK 水平与严重鼻息肉患者的组织嗜酸性粒细胞数量正相关。

图4：GZMK 通过切割补体成分激活补体级联反应

该图阐明 GZMK 的作用机制。A-B 为 GZMK 底物筛选流程，通过无活性突变体 GZMK-S214A 免疫沉淀结合质谱鉴定底物;C-D 显示 3 例患者共有的 56 个 GZMK 结合蛋白，包括已知底物 SET 和新发现的补体成分;E-F Edman 测序和 Western blot 证实，GZMK 切割 C3 的 α 链(R748 位点)释放 C3a;G-H 验证 GZMK 还可切割 C2、C4 生成 C2a、C4a(促进经典补体途径)，切割 C5 增强膜攻击复合物活性。

图5：敲除 GZMK 可减轻气道炎症并恢复肺功能

该图验证 GZMK 的体内功能。A 为实验设计，在小鼠哮喘模型中不同阶段诱导 GZMK 敲除;B 显示敲除 GZMK 后，支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量显著减少;C-D 肺功能检测和 AB-PAS 染色证实，敲除 GZMK 可改善气道高反应性，减少杯状细胞增生;E 定量分析显示 PAS 阳性区域面积显著降低，证实黏膜损伤减轻。

全文总结

本研究在复发性气道炎症领域取得三大核心突破：一是发现表达 GZMK 的 CD8⁺T 细胞克隆是驱动气道炎症复发的关键细胞亚群，其可在疾病缓解后持续存在并在复发时再定植;二是阐明其作用机制为 GZMK 通过切割多种补体成分激活补体级联反应，释放 C3a 等促炎介质招募嗜酸性粒细胞等效应细胞，形成炎症放大环路;三是提供了靶向治疗策略，无论是基因敲除还是药物抑制 GZMK，均能有效减轻炎症损伤并恢复肺功能，且组织 GZMK 水平可作为疾病严重程度的优质预测标志物。

该研究的临床转化价值显著：GZMK 可作为复发性气道炎症的新型诊断标志物，帮助精准评估疾病风险;针对 GZMK 的抑制剂(如 PPACK)或靶向抗体有望开发为新型治疗药物，突破现有治疗难以根治复发的瓶颈。未来需通过更大规模的前瞻性临床试验，进一步验证 GZMK 抑制剂的临床疗效，为慢性复发性气道炎症疾病提供新的治疗方向。