基于创新表位预测指导剪接的工程化策略设计多功能重组疫苗

基本信息

英文标题：Designing multifunctional recombinant vaccines: an engineering strategy based on innovative epitope prediction-guided splicing

中文标题：基于创新表位预测指导剪接的工程化策略设计多功能重组疫苗

发表期刊：《Theranostics》

影响因子：13.3

作者单位：

北京大学深圳研究生院

南方医科大学

岳阳市中心医院等

作者信息：

Zhidong Wang, Xiaolin Yang, Xiaoyi Wei, Licai Shi, Xuechun Wang, Zhenjian Zhuo, Hailong Su, Wengao Wu, Yu J. Cao

研究背景

研究背景：

1.临床/生物学问题：

重组亚单位疫苗(如针对EB病毒相关鼻咽癌的疫苗)面临免疫原性低、半衰期短、抗原选择困难等挑战，限制了其治疗效果。

2.现有研究的局限性：

传统多组分疫苗(如抗原+佐剂+缓释材料)常通过非共价结合组装，导致批次一致性差、生产工艺复杂。单表位疫苗免疫反应有限。

3.研究切入点与创新点：

本研究建立了一个多功能重组疫苗设计平台，通过计算机辅助表位预测与剪接，构建表位富集区(EER)，并融合TLR4激动剂(hEDA)增强免疫原性，融合IgG1 Fc片段延长半衰期，实现单分子多功能整合。

研究方法

1.动物模型构建：

使用C57BL/6J小鼠，建立TC1/LMP2A和MC38/LMP2A两种表达EBV抗原LMP2A的肿瘤细胞系，用于预防性和治疗性肿瘤模型。

2.细胞培养与处理：

使用人树突状细胞(DC)、T细胞、RAW264.7巨噬细胞、THP1细胞、293T细胞等，进行DC-T细胞共培养、TLR4结合与激活、细胞摄取等实验。

3.材料合成与表征：

通过同源重组构建pET-32a表达载体，表达B-hEDA-T3-Fc、B-hEDA-T5-Fc等疫苗候选物。使用SDS-PAGE、LC-MS进行纯度和分子量表征。

4.功能实验：

表位预测：使用IEDB、VaxiJen、AllerTOP、Toxinpred等工具预测CTL、HTL和B细胞表位。

DC成熟检测：流式细胞术检测CD86表达。

T细胞激活：IFN-γ胞内染色、CFSE增殖实验、ELISpot。

抗原摄取与溶酶体共定位：免疫荧光检测RAB7与疫苗共定位。

TLR4结合与激活：流式检测结合，ELISA检测TNF-α分泌。

体内抗肿瘤实验：肿瘤体积、体重、生存曲线、H&E染色、免疫组化(CD3+ T细胞浸润)。

5.体内实验：

预防性模型：三次免疫后接种肿瘤细胞。

治疗性模型：接种肿瘤后次日开始免疫，联合或不联合PD-1抑制剂(BMS-1)。

免疫组化检测肿瘤组织CD3+ T细胞浸润。

实验结果

图1 | LMP2A靶向重组疫苗的表位预测与设计

A：重组疫苗结构示意图，展示B、T3、T5在LMP2A序列上的位置，以及hEDA和Fc的融合方式。

B：B、T3、T5中相邻和重叠表位的注释，以及每个EER的表位密度量化。

C：通过SDS-PAGE评估重组疫苗的纯度和分子量，显示还原性SDS-PAGE结果及分子量标志物。

D：通过LC-MS精确测量重组疫苗的分子量，结果显示观察到的分子量与预期值一致。

图2 | 重组疫苗诱导HLA同型依赖性T细胞激活与增殖

A：DC-T细胞共培养实验示意图。从HLA匹配的供体中分离PBMC，分离DC并诱导成熟，重组疫苗在DC成熟过程中加入，随后自体T细胞与成熟DC共培养9天，评估IFN-γ产生和T细胞扩增。

B：5名健康供体CD8+ T细胞在不同疫苗刺激后IFN-γ产生情况总结，无刺激为阴性对照。

C：使用细胞分裂追踪剂CFSE通过流式细胞术评估T细胞扩增，并显示T细胞扩增的量化结果，每组均进行重复测试。数据以均值±SD表示。采用双因素方差分析及Tukey多重比较检验计算统计学显著性，p值小于0.05时认为具有显著性(p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001)。

图3 | B-hEDA-T3-Fc和B-hEDA-T5-Fc在TC1/LMP2A预防性模型中的差异抗肿瘤活性

A：TC1/LMP2A预防性实验流程概览。C57BL/6J小鼠(n=5)皮下免疫1 nmol B-hEDA-T3-Fc或B-hEDA-T5-Fc，并在第14和28天以相同剂量加强免疫，PBS作为对照。末次免疫后10天，将2×10⁶个TC1/LMP2A细胞接种于小鼠右侧 flank。

B：监测肿瘤体积直至体积达到2000 mm³或肿瘤组织严重溃烂。肿瘤体积按W×L×H计算，使用数字卡尺测量。每个数据点代表每组5只小鼠的均值±SD。

C：TC1/LMP2A预防性模型中各组小鼠体重(n=5)。

D：末次免疫后7天收集各组血清，使用TC1/LMP2A细胞ELISA评估血清抗体滴度。每个稀释度进行重复实验(n=3)。

E：实验终点收集肿瘤组织，免疫组化检测肿瘤组织中CD3+ T细胞浸润。比例尺为100 μm。标记区域放大以展示CD3+ T细胞浸润情况。统计学显著性采用双因素方差分析及Tukey多重比较检验，p<0.05时认为具有显著性(p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001)。

图4 | B-hEDA-T3-Fc和B-hEDA-T5-Fc诱导的细胞免疫及功能表位验证

A：将RAW264.7细胞与100 nM疫苗孵育1小时，观察重组疫苗与溶酶体的共定位。免疫荧光染色使用相应抗体(品红色：AF647-抗RAB7;蓝色：Hoechst;绿色：AF488-抗Flag)。最后一张图比例尺为10 μm。

B：综合荧光密度共定位的量化结果(n=28)。

C：通过胞内细胞因子染色检测抗原特异性T细胞。雌性C57BL/6J小鼠(n=3)每两周免疫一次，共三次。末次免疫后10天，收集脾细胞，用相应疫苗(10 μg/mL)刺激24小时，最后5小时加入2 μM布雷菲德菌素A，流式细胞术检测IFN-γ。展示末次免疫后疫苗诱导的IFN-γ T细胞统计结果(n=3)。

D：T3中合成表位的图示和序列总结。

E：使用Epi 1至Epi 7刺激后的ELISpot结果(n=3)，nega为阴性对照。

F：E图中斑点形成单位(SFU)的统计分析。数据以均值±SD表示。采用双因素方差分析及Tukey多重比较检验计算统计学显著性，p<0.05时认为具有显著性(p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001)。

图5 | B-hEDA-T3-Fc的抗肿瘤活性优于拆分组分疫苗

A：B-hEDA-T3-Fc拆分组分疫苗设计示意图。

B：B-hEDA-T3-Fc及其拆分组分疫苗的TLR4结合亲和力。

C：将0.5×10⁶个RAW264.7细胞在玻片上培养24小时，加入100 nM疫苗，继续培养1小时后固定、透化并染色，展示荧光综合密度的量化结果(n=11)。

D：通过检测经指定疫苗处理的小鼠分离的脾细胞中疫苗特异性IFN-γ T细胞来分析细胞免疫(n=3)。每组小鼠均以等摩尔剂量1 nmol免疫。第三次免疫后7天收集脾细胞，展示脾细胞群中IFN-γ T细胞的量化结果。

E：1:20稀释度下的血清抗体滴度结果，数据分开显示。

F：MC38/LMP2A治疗性模型中的肿瘤体积和G)体重，每周监测两次(n=6)。

H：Kaplan-Meier曲线展示接受指定疫苗治疗小鼠的总生存期(n=6)。

I：MC38/LMP2A肿瘤组织中小鼠CD3+细胞的浸润情况，展示代表性图像，比例尺为50 μm。数据以均值±SD表示。采用双因素方差分析及Tukey多重比较检验，p<0.05时认为具有显著性(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。

图6 | 重组疫苗与PD-1抑制剂在治疗模型中的协同抗肿瘤活性

A：治疗实验流程示意图。将2×10⁶个TC1/LMP2A或1×10⁶个MC38/LMP2A细胞接种于六周龄C57BL/6小鼠右侧 flank(n=5)。次日皮下给予1 nmol重组疫苗，每隔5天再给予两次。每次免疫后两天，腹腔注射100 μL BMS-1(10 μg/mL)。

B：MC38/LMP2A治疗实验中肿瘤体积和C)体重的监测。

D：Kaplan-Meier曲线展示(A)中所示各组小鼠的总生存期，数据采用对数秩检验分析。

E：MC38/LMP2A治疗实验中，末次免疫后7天分离的脾细胞IFN-γ ELISpot分析结果(n=3)。

F：脾细胞群中IFN-γ+ T细胞的量化结果(n=3)。末次免疫后7天收集脾细胞，用B-hEDA-T3-Fc刺激后分析斑点形成单位数量。

G：MC38/LMP2A肿瘤组织中小鼠CD3+细胞的浸润情况，展示代表性图像，比例尺为100 μm。

H：TC1/LMP2A治疗实验中的肿瘤体积监测和I)生存曲线(n=5)。

J：TC1/LMP2A治疗模型中脾细胞中IFN-γ+ T细胞数量的总结(n=3)。数据以均值±SD表示。采用双因素方差分析及Tukey多重比较检验，p<0.05时认为具有显著性(p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001)。

研究结论

本研究建立了一个精准设计多功能重组疫苗的平台，成功应用于靶向LMP2A的疫苗开发。结果表明：

1.表位预测指导的疫苗设计是一种高效、有前景的抗原筛选方法。

2.通过表位剪接策略(EER)融合TLR4激动剂(hEDA)和长效分子(IgG1 Fc)，可实现单分子多功能整合。

3.优化后的B-hEDA-T3-Fc疫苗在预防性和治疗性模型中均显著诱导体液和细胞免疫，抑制肿瘤生长。

4.与PD-1抑制剂联合使用具有协同抗肿瘤效果，显著延长生存期。

5.该策略为鼻咽癌及其他疾病的疫苗开发提供了新平台。

文献意义:

1.首次系统描述了将计算机表位预测、EER剪接、TLR4激动剂和长效分子整合到单分子重组疫苗中的设计策略。

2.实现了疫苗免疫原性、半衰期和T细胞应答的协同优化，解决了传统多组分疫苗的一致性和工艺复杂性问题。

3.验证了MHC等位基因依赖性的个性化疫苗效果，为未来精准疫苗设计提供了理论基础。

4.展示了与免疫检查点抑制剂联合应用的潜力，为冷肿瘤治疗提供了新策略。