原人参三醇通过激活EGFR和HER2增强人角质形成细胞中皮肤保护相关分子的表达

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：Protopanaxatriol activates EGFR and HER2 to strengthen the molecules of skin protection in human keratinocytes

中文标题：原人参三醇通过激活EGFR和HER2增强人角质形成细胞中皮肤保护相关分子的表达

发表期刊：《Phytomedicine》

影响因子：8.3

作者单位：

1.Department of Integrative Biotechnology, Sungkyunkwan University, Suwon, Republic of Korea

2.Jiangsu Key Laboratory of Experimental & Translational Non-Coding RNA Research, School of Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China

作者信息：

第一作者：Long You

通讯作者：Jae Youl Cho

研究背景

皮肤是人体最大的器官，角质形成细胞作为表皮的主要组成细胞，通过分泌丝聚合蛋白、转谷氨酰胺酶-1等结构蛋白维持皮肤屏障，并通过合成透明质酸等保湿因子维持皮肤水合作用。维A醇(视黄醇)是化妆品中广泛使用的抗衰老成分，但其存在干燥、发红、刺激等副作用。人参及其活性成分人参皂苷具有抗炎、抗氧化、抗衰老等多种功效，其中原人参三醇是一种人参皂苷的次级代谢产物。前期研究已发现PPT可通过激活NF-κB、MAPKs等信号通路增强皮肤屏障和保湿相关分子的表达，但其直接作用的细胞靶点尚不明确。本研究旨在鉴定PPT在角质形成细胞中上调透明质酸合成酶HAS-2的上游靶点，并阐明其分子机制。

研究方法

本研究采用人角质形成细胞HaCaT和人胚肾细胞HEK293T。通过RT-PCR和Western blot检测HAS-2、FLG、occludin等分子的mRNA和蛋白表达。利用荧光素酶报告基因实验检测AP-1、NF-κB、STAT3、CREB转录活性。通过质粒转染过表达EGFR或HER2，或使用shRNA敲低PPARγ，观察上下游信号变化。采用定点诱变构建EGFR和HER2的突变体(L718A、F723A、V726A、A743A、M793A、L844A等)。通过细胞热位移实验验证PPT与EGFR/HER2的直接结合。检测PPT对PI3K/PDK1/Akt、JAK1/STAT3、CaMKII/AMPKα、PKA等信号通路磷酸化的影响。所有实验重复三次，数据以均值±SD表示，采用t检验。

实验结果

图 1：PPT与PPD对皮肤保湿效果的比较

图1A展示了PPT和PPD的化学结构差异(PPT多一个羟基)。图1B和1D显示，PPT在浓度依赖(5-20 μM)和时程依赖(24-72 h)下显著提升HAS-2的mRNA和蛋白水平，而PPD无此效果。20 μM PPT效果最佳，甚至超过维A醇。图1E-F进一步确认了PPD的无效。该结果表明，PPT对皮肤保湿具有特异性，而其前体PPD无此功能，为后续机制研究奠定了基础。细胞增殖实验(图2I)证实PPT不引起明显的细胞过度增殖。

图 2：PPT与维A醇对信号通路的比较

图2A-D的荧光素酶报告基因实验显示，PPT显著激活NF-κB、AP-1、STAT3和CREB信号通路;其中PPT对NF-κB的激活作用强于维A醇，对其他通路的激活效果略低于维A醇。图2E的Western blot证实PPT处理后上述转录因子的核转位增加。图2F通过使用各通路特异性抑制剂，结合RT-PCR检测FLG、occludin、HAS-1、HAS-2的表达，明确了不同转录因子对保湿和屏障分子的调控作用。该结果表明PPT可作为维A醇的安全替代品。

图 3：PPT对皮肤保湿相关信号通路的激活机制

图3A显示PPT浓度依赖性增强PI3K、PDK1、Akt的磷酸化。图3B显示PPT在20 min内增强JAK1和STAT3磷酸化。图3C显示PPT抑制PPARγ蛋白水平，效果与维A醇相当。图3D显示在稳定敲低PPARγ(图3E验证敲低效率)的HaCaT细胞中，HAS-2 mRNA显著上调。图3E进一步显示PPARγ敲低激活Src Y416磷酸化，但不影响Y527。图3F-G显示PPT增强CaMKII、AMPKα和PKA的磷酸化。这些结果表明PPT通过抑制PPARγ、激活Src/PI3K/Akt、JAK/STAT3、CaMKII/AMPKα、PKA等多条信号通路共同上调HAS-2。

图 4：PPT作用的细胞靶点——EGFR和HER2

基于前期报道(L-AHG通过EGFR促进HAS-2)，图4A显示PPT在20 μM下20 min内显著诱导EGFR和HER2的磷酸化。图4B的激酶活性测定证实PPT增强HER2的激酶活性。图4C和4E显示过表达HER2或EGFR后，PPT进一步增强其自身磷酸化(自磷酸化)。图4D显示HER2过表达增加Src Y416磷酸化和HAS-2蛋白，但不影响AMPKα;图4F显示EGFR过表达增加CaMKII磷酸化和HAS-2。这些结果首次证明PPT通过直接激活受体酪氨酸激酶EGFR和HER2来启动下游信号级联，从而促进皮肤保湿。

图 5：PPT与EGFR/HER2的结合位点

图5A-B的细胞热位移实验显示，PPT处理显著增强了内源性EGFR和HER2的热稳定性，表明PPT与这两种蛋白直接结合。图5C对EGFR和HER2不同物种的氨基酸序列进行比对，发现Zhao等人报道的PPT与EGFR结合的8个残基在HER2中高度保守。图5D-E对6个保守残基(EGFR L718、F723、V726、A743、M793、L844;对应HER2 L726、F731、V734、A751、M801、L852)进行定点诱变后，CETSA显示：Val726(EGFR)和Leu852(HER2)突变导致蛋白热稳定性丧失;其余5个残基突变后PPT仍能稳定蛋白;其中Met793(EGFR)和Val734(HER2)对PPT的稳定作用最为关键。图5F展示了PPT与HER2激酶结构域(3PPO)的分子对接模型。这些结果精确定位了PPT与EGFR/HER2相互作用的氨基酸残基。

图 6：全文机制总结图

该图整合了所有发现：PPT直接结合并激活EGFR和HER2，进而通过多条途径(Src/PI3K/PDK1/Akt/NF-κB、JAK/STAT3、CaMKII/AMPKα、GPCR/PKA)上调转录因子(NF-κB、AP-1、STAT3、CREB)，最终增强皮肤屏障蛋白(FLG、TGM-1、occludin)和保湿因子(HAS-2、HAS-3)的表达。同时PPT通过抑制PPARγ进一步协同激活Src。该图清晰地展示了PPT的完整分子网络。

研究结论

本研究首次揭示了原人参三醇在正常人角质形成细胞中通过直接靶向表皮生长因子受体和人类表皮生长因子受体2来增强皮肤屏障和保湿功能的分子机制。PPT通过结合EGFR/HER2的特定氨基酸残基(尤其是EGFR Met793和HER2 Val734)，激活其自身磷酸化，进而触发下游Src/PI3K/PDK1/Akt/NF-κB、JAK1/STAT3、CaMKII/AMPKα以及PKA等多条信号通路，上调转录因子AP-1、NF-κB、STAT3和CREB的活性，最终促进皮肤屏障相关蛋白(FLG、occludin)和保湿因子(HAS-2、HAS-3)的表达。此外，PPT还通过抑制PPARγ进一步提升Src活性。与传统维A醇相比，PPT不仅能有效促进皮肤保湿，且无明显细胞毒性或过度增殖作用。这些发现为人参皂苷在化妆品领域的应用提供了理论依据，并为开发安全的抗皮肤老化产品提供了新候选分子。