Fluc示踪下的卵巢癌腹膜转移新疗法：mRNA-LNP递送IL-12/IL-15/IL-18+Caspase-1重编程肿瘤微环境

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：A novel mRNA-based multi-cytokine strategy to reprogram the peritoneal tumor microenvironment in ovarian cancer

中文标题：一种基于mRNA的新型多细胞因子策略重编程卵巢癌腹膜肿瘤微环境

发表期刊：《Journal of Nanobiotechnology》

影响因子：12.6

作者单位：

1.Department of Medical and Biological Sciences, The Catholic University of Korea, Bucheon, Republic of Korea

2.BK Four Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, Bucheon, Republic of Korea

3.Department of Biomedical Laboratory Science, Daegu Haany University, Gyeongsan, Republic of Korea

4.OGANOIDSCIENCES, Inc, Seongnam-si, Gyeonggi-do, Republic of Korea

5.Department of Obstetrics and Gynecology, Gangnam Severance Hospital, Institute of Women's Life Medical Science, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Republic of Korea

6.Institute of Occupation and Environment, Korea Workers' Compensation & Welfare Service, Incheon, Republic of Korea

7.National Institute of Health, Korea Disease Control and Prevention Agency, Cheongju-si, Chungcheongbuk-do, Republic of Korea

作者信息：

第一作者：Yu-Sun Lee, Jisun Lee, Yeeun Lee, Hyunho Yoon

通讯作者：Jae-Hwan Nam

研究背景

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，其特点是早期腹膜转移和恶性腹水积聚，导致预后极差。腹膜肿瘤微环境高度免疫抑制，髓系细胞和调节性T细胞大量浸润，效应T细胞功能受抑。细胞因子免疫疗法(如IL-12、IL-15、IL-18)具有激活抗肿瘤免疫的潜力，但临床应用中存在系统毒性大、肿瘤部位递送效率低等问题。此前临床试验(如Bechter等)尝试使用编码单链IL-12、IL-15和IFNα2b的mRNA混合物，但疗效不足且毒性明显。本研究设计了一种创新的腹腔内mRNA-脂质纳米颗粒递送策略，同时递送IL-12、IL-15、pro-IL-18和Caspase-1，其中Caspase-1可将pro-IL-18切割为成熟活性形式，协同增强Th1型免疫应答。研究旨在评估该多细胞因子mRNA组合在ID8-Fluc卵巢癌小鼠模型中对腹膜微环境的重编程作用及其抗肿瘤疗效。

研究方法

研究构建了基于pGH载体的mRNA表达平台，编码序列包括scIL-12(p35-p40融合)、scIL-15(与IL-15Rα sushi域融合)、pro-IL-18和Caspase-1。通过体外转录合成mRNA，使用SM-102等脂质组分制备LNP，粒径和zeta电位经Zetasizer表征。在C57BL/6小鼠腹腔注射ID8-Fluc细胞建立腹膜转移模型，2周后开始每周一次腹腔注射mRNA-LNP(初始剂量20 μg/细胞因子，减量实验中总mRNA 15 μg)。通过ELISA检测血清和腹腔灌洗液中细胞因子水平;流式细胞术分析脾脏、腹水和附睾白色脂肪组织中免疫细胞亚群(CD4+、CD8+ T细胞、Treg、巨噬细胞、单核细胞等);体内生物发光成像监测肿瘤负荷和转移灶;ELISpot检测IFN-γ产生;RNA-seq分析腹膜细胞转录组变化(差异表达基因、GO富集、PCA等)。安全性评估包括体重、肝功能指标(AST、ALT)和死亡率。

实验结果

图 1：mRNA构建体设计与腹腔内免疫细胞分布

图1A展示了四种mRNA构建体的示意图：scIL-12(p35-p40融合)、scIL-15(与IL-15Rα sushi域融合)、pro-IL-18和Caspase-1。图1B显示腹腔注射后1小时和6小时的细胞因子水平：血清中IL-12在1小时达峰(约20,000 pg/mL)，6小时仍维持高位;IL-15血清水平6小时更高;IL-18在Caspase-1共给药时显著增强，且腹腔液中IL-18仅在Caspase-1存在下6小时显著升高，证明Caspase-1对IL-18激活的关键作用。图1C显示GFP-mRNA-LNP腹腔注射24小时后，单核细胞和树突状细胞的GFP阳性率最高(>10%)，中性粒细胞、巨噬细胞、B细胞和CD4+ T细胞中等(4-5%)，CD8+ T细胞最低(<1%)。表明mRNA-LNP优先被髓系细胞摄取。

图 2：IL-12单药及联合治疗的抗肿瘤效果

图2A-B为实验设计：ID8-Fluc细胞腹腔注射后2周开始每周一次mRNA-LNP治疗，共3周。图2C显示腹围变化：联合治疗组(IL-12/IL-15/IL-18/CASP1)在第19天腹围显著减小(p<0.0001)，而单药组(IL-15反而增大腹围)。图2D和2F的生物发光成像显示联合治疗组肿瘤信号下降最显著，IL-12单药也有明显抑制。图2E Kaplan-Meier生存曲线显示联合治疗组和IL-12组生存期延长，但联合组出现一例死亡(可能与毒性相关)。说明联合治疗抗肿瘤效果最强，但存在毒性风险。

图 3：抗转移效果

图3A展示各器官离体生物发光成像，图3B-C量化各器官肿瘤信号比例。Nil、MCS和IL-15组肿瘤广泛播散至多个器官;IL-18/CASP1组轻度减少;IL-12单药组在胰腺和肠系膜转移减少显著;联合治疗组几乎在所有器官中消除了可检测的转移灶。eWAT(附睾白色脂肪组织)是转移负荷最高的部位，联合治疗组信号最低。说明联合治疗能强效抑制腹膜内多器官转移。

图 4：髓系细胞重塑

图4A显示联合治疗组腹水量显著减少。图4B显示肿瘤细胞(EpCAM+)在腹水中比例在IL-12和联合组中最低。图4C显示CD45+免疫细胞在腹水和eWAT中联合组比例最高。图4D显示巨噬细胞在腹水中IL-12和联合组比例升高(可能为单核细胞浸润所致)。图4E显示巨噬细胞极化：在腹水和eWAT中，IL-12和联合组中M2(CD86-CD206+)比例下降，出现更多CD86-CD206-的过渡态细胞，表明向促炎表型转变。图4F显示单核细胞在腹水中IL-12和联合组显著增加。证明联合治疗促进单核细胞募集和巨噬细胞重编程。

图 5：T细胞重编程

图5A显示脾脏、腹水和eWAT中CD8+和CD4+ T细胞频率在IL-12和联合组显著升高。图5B显示效应T细胞(CD127-KLRG1+)在联合组中显著增加。图5C-D显示脾脏IFN-γ ELISpot：IL-12单药和联合组均显著增加IFN-γ产生细胞，IL-12单药效果更强。图5E-F显示Treg(CD4+CD25+CD127-)在脾脏中IL-12和联合组降低，在腹水中联合组降低最明显。图5G-H显示衰竭标志物：腹水中Tim-3+ CD8+ T细胞在IL-12和联合组降低;eWAT中PD-1+ CD4+ T细胞在联合组显著降低。说明联合治疗增强效应T细胞、减少Treg和衰竭标志物。

图 6：减量治疗的安全性与疗效

图6A-B为减量实验设计：总mRNA 15 μg(各细胞因子5 μg)，组合包括R/L对照、IL-12单药、IL-12/IL-18/CASP1、IL-15/IL-18/CASP1、IL-12/IL-15/IL-18/CASP1。图6C显示腹围变化：含IL-12的组合(双联或三联)均显著减小腹围。图6D和6F显示肿瘤负荷：IL-12/IL-18/CASP1和IL-12/IL-15/IL-18/CASP1均有效抑制肿瘤，与高剂量效果相当。图6E生存曲线：高剂量联合组曾出现死亡，减量联合组无治疗相关死亡，体重和肝功能正常。证明减量联合治疗可维持疗效且安全性改善。

图 7：转录组分析揭示联合治疗的分子机制

图7A热图显示联合治疗组样本与单细胞因子处理组明显分离，呈现独特的转录特征。图7B主成分分析证实联合治疗组与其他组显著区分，表明全局转录重编程。图7C GO富集分析显示联合治疗组上调基因富集于“对外部刺激的细胞应答”、“代谢和细胞过程调控”、“应激反应”和“信号转导”等生物学过程。图7D火山图显示联合治疗相对于单药平均值的差异表达基因。图7E总结了关键基因：M2相关标志物(ARG1、CHIL3、MRC1)上调;凋亡调节因子PDCD4、PDCD6下调，PDCD10上调;NF-κB信号中RELA下调、NKRF(负调节因子)上调;STAT相关调节因子NFIB、NFAT5下调。经典M1标志物未显著富集。表明联合治疗通过协调调节免疫、代谢和应激通路实现免疫重编程，而非单纯诱导经典炎症。

研究结论

本研究开发了一种基于mRNA-LNP的腹腔内多细胞因子治疗策略，同时递送IL-12、IL-15、pro-IL-18和Caspase-1，用于重编程卵巢癌腹膜转移微环境。在ID8-Fluc同基因小鼠模型中，该组合显著抑制肿瘤生长、减少腹水和多器官转移，其效果优于各细胞因子单药。机制上，mRNA-LNP优先被髓系细胞(单核细胞、树突状细胞)摄取，联合治疗促进单核细胞浸润和巨噬细胞向M1样表型转变，同时增加CD8+和CD4+效应T细胞浸润，降低Treg比例和T细胞衰竭标志物(Tim-3、PD-1)。尽管高剂量治疗引起肝毒性和体重下降，减量方案(总mRNA 15 μg)保持抗肿瘤效果且安全性良好。RNA-seq揭示联合治疗诱导腹膜免疫细胞发生协调的转录重编程，涉及代谢调节、应激反应和免疫信号通路的精细调控，而非简单的炎症放大。该研究为基于mRNA的局部多细胞因子免疫治疗提供了概念验证，并展示了其在卵巢癌及其他免疫抑制性实体瘤中的转化潜力。