无需外源因子！含小胶质细胞的脑类器官模型实现 9 周以上长期培养

小胶质细胞是脑内固有免疫细胞，对脑发育、突触修剪和神经炎症至关重要，但多数 hiPSC 衍生脑类器官因源于神经外胚层天然缺乏该细胞。现有整合模型需昂贵外源因子或无法长期维持小胶质存活，难以模拟生理互作。

美国约翰霍普金斯大学团队在《Frontiers in Cellular Neuroscience》上发表题为Microglia-containing neural organoids as brain microphysiological systems for long-term culture的研究，开发免疫 competent 脑微生理系统(μbMPS)，通过 U 型底 96 孔板混合 hiPSC 衍生神经祖细胞(NPC)与小胶质前体细胞(PM)，无需外源因子即可实现小胶质长期整合(≥9 周)，且能促进神经网络成熟、响应损伤与炎症，为相关研究提供新工具。

实验方法

1.细胞分化：hiPSC(NIBSC-8 系)24 天诱导为小胶质前体细胞(PM)，8 天成熟后表达 CD11b/TREM2;hiPSC 7 天分化为神经祖细胞(NPC)，传代 5 次后 SOX2/Nestin 阳性率>90%，细胞无支原体污染、核型正常。

2.μbMPS 构建：仅 U 型底 96 孔板按 50:50 比例接种 1000 NPC+1000 PM，静态培养 3 天后转 6 孔板摇床培养(88 rpm)，无需小胶质特异性因子;设无小胶质的 bMPS⁹⁶⁻⁶和传统 bMPS⁶⁻⁶为对照。

3.检测方法：免疫荧光测细胞标志物，钙成像 / HD-MEA 检测神经电活动，pHrodo 红标颗粒测吞噬能力，离心建立 TBI 模型观察响应;qRT-PCR 和 RNA-seq(GRCh38 基因组)分析分子特征。

关键结果

图1：hiPSC 衍生小胶质细胞的分化验证

hiPSC 成功分化为 CD34/43/45 阳性造血前体细胞，进一步分化的小胶质高表达成熟标志物 CD11b(细胞膜)和 TREM2(吞噬相关)，证实分化纯度与成熟度。

图2：小胶质细胞的激活与吞噬功能

LPS 刺激后，小胶质呈浓度依赖性激活(形态趋向阿米巴样、CD68 区域缩小);能吞噬 pHrodo 红标大肠杆菌颗粒，颗粒进入酸性吞噬溶酶体后荧光增强，证实吞噬功能正常。

图3：μbMPS 构建优化与小胶质基因特征

U 型底 96 孔板生成的类器官大小均一，85.7% 含小胶质，显著优于其他板型;2 周龄 μbMPS 的 RNA-seq 显示 SALL1、HEXB 等小胶质相关基因富集，8 周龄小胶质呈静息态分支形态。

图4：小胶质细胞长期存活

小胶质在 μbMPS 中存活≥9 周，呈分支状(静息态)或阿米巴样(激活态)，均匀分布并表达 P2RY12(特异性)和 PU.1(转录因子)。

图5：神经细胞组成不受小胶质影响

qRT-PCR 显示，μbMPS 与对照类器官的神经元(MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)、少突胶质细胞(MBP)及突触标志物(SYP)表达无显著差异;突触密度分析证实两者突触数量无统计学差异。

图6：神经细胞类型完整性

6-8 周龄 μbMPS 中，免疫荧光检测到神经元(NF200/β-III - 微管蛋白)、少突胶质细胞(O4)、星形胶质细胞(GFAP)与小胶质(IBA1)共存，证实神经细胞组成完整。

图7：小胶质促进神经电活动

3 周龄 μbMPS 出现明显网络爆发式钙信号，无小胶质的 bMPS⁹⁶⁻⁶无自发活动，钙信号参数量化显示 μbMPS 活性更优。

图8：HD-MEA 验证神经成熟

μbMPS 的活性区域占比、放电频率、爆发持续时间显著高于对照，轴突长度更长，证实神经电活动与轴突生长优化。

图9：小胶质响应损伤与吞噬

TBI 模型中，小胶质 4-24 小时向类器官表面迁移聚集;能吞噬 pHrodo 红标颗粒，且颗粒与溶酶体(CD68)共定位。

图10：小胶质的炎症响应

LPS 或 TNFα 刺激后，μbMPS 特异性释放小胶质相关细胞因子 MIP-1α/β，对照类器官无此响应，证实炎症介导作用。

全文总结

本研究开发的 μbMPS 模型无需外源小胶质因子，即可实现小胶质与神经类器官长期整合(≥9 周)。小胶质能维持吞噬、炎症响应等功能，还能促进神经网络电活动成熟，且不干扰神经分化与突触形成。模型标准化高、可规模化，解决传统类器官免疫缺陷问题，适用于神经发育研究、疾病建模及药物筛选。局限性在于未做单细胞转录组细分细胞亚型，未来可结合患者 hiPSC 拓展疾病特异性模型。