一个快速进展的原位卵巢癌模型揭示了AXL靶向纳米抗体与奥拉帕尼的协同抗肿瘤效应

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。逸漠生物自主研发了近200种表达Fluc的细胞系，均经过荧光素酶活性检测验证，可满足科研人员的多样化需求，欢迎咨询。

基本信息

英文标题：A fast-progressing orthotopic ovarian cancer model reveals synergistic antitumor effects of AXL-targeting nanobodies and Olaparib

中文标题：一个快速进展的原位卵巢癌模型揭示了AXL靶向纳米抗体与奥拉帕尼的协同抗肿瘤效应

发表期刊：《Gynecologic Oncology Reports》

影响因子：1.3

作者单位：

1. Lab of Dendritic Cell Biology and Cancer Immunotherapy, VIB Center for Inflammation Research, Brussels, Belgium

2. Lab of Cellular and Molecular Immunology, Brussels Center for Immunology, Vrije Universiteit Brussel, Brussels, Belgium

3. Lab of Tumor Immunology and Immunotherapy, Department of Oncology, Leuven Cancer Institute, KU Leuven, Leuven, Belgium

4. Translational Oncology Research Center, Lab of Hematology and Immunology, Vrije Universiteit Brussel, Brussels, Belgium

5. Translational Oncology Research Center, Lab of Hematology and Immunology, Universitair Ziekenhuis Brussel (UZ Brussel), Brussels, Belgium

作者信息：

第一作者(共同一作)：

Aarushi A. Caro

Alicia Gordun Peiro

通讯作者(共同通讯)：

An Coosemans

Damya Laoui

研究背景

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，患者常因晚期诊断和高复发率而预后不良。AXL受体酪氨酸激酶在卵巢癌中高表达，与疾病进展和耐药性密切相关。尽管已有多种靶向AXL的疗法进入临床研究，但其在卵巢癌中的疗效仍有限。本研究旨在建立一种更快速、更贴近临床的卵巢癌原位小鼠模型，并探索一种新型AXL靶向纳米抗体(AXL-Fc)及其与PARP抑制剂奥拉帕尼联合治疗的抗肿瘤效果。

研究方法

研究团队通过三次体内传代培养了更快速进展的P3 ID8 Thy1.1卵巢癌细胞系，并将其原位注射至C57BL/6小鼠卵巢中，建立原位卵巢癌模型。通过流式细胞术和免疫荧光检测AXL表达，ELISA检测血清GAS6水平。利用公共数据库(KM Plotter、scDVA)分析AXL和GAS6与患者预后及铂类耐药的关系。将原位肿瘤组织制备成单细胞悬液，体外给予AXL-Fc、奥拉帕尼或二者联合处理24或72小时，通过流式细胞术检测细胞死亡(凋亡/坏死)和增殖(Ki67)情况。

实验结果

图 1：三次体内传代建立的P3 ID8 Thy1.1细胞株显著加速卵巢癌进展

作者首先将ID8-fluc细胞原位注射到小鼠卵巢中，发现这些小鼠需要长达111天才能达到人道终点(定义为体重增长75%或出现严重腹水等)。为了获得进展更快的模型，他们进行了连续三次体内传代：从荷瘤小鼠中取出肿瘤组织，体外培养获得下一代ID8细胞，再重新注射到新的小鼠卵巢中。经过第一次传代获得的P1 ID8细胞，小鼠在接种后50天即达到人道终点;第二次传代获得的P2 ID8细胞将这一时间缩短至46天;进一步对P2 ID8细胞进行慢病毒转导使其稳定表达Thy1.1报告蛋白(P2 ID8 Thy1.1)，小鼠在61天达到终点;第三次传代后获得的P3 ID8 Thy1.1细胞，小鼠仅在42天就达到人道终点。相比之下，原始ID8-fluc细胞需要111天，而P3 ID8 Thy1.1细胞的肿瘤进展速度提高了近3倍，且所有接种小鼠均成功成瘤(100% engraftment)。这一模型的建立为后续治疗药物的快速体内筛选提供了高效、可重复的工具。

图 2：P3 ID8 Thy1.1原位模型能够模拟人卵巢癌从I期到III期的临床进展

研究团队通过解剖学和生物发光成像对P3 ID8 Thy1.1肿瘤小鼠的疾病进程进行了详细的评估。在接种后42天，肿瘤不仅出现在最初注射的右侧卵巢，还自发转移到了对侧(左侧)未注射的卵巢，并进一步扩散至子宫和输卵管区域。根据FIGO分期标准，这对应于人卵巢癌的II期(肿瘤超出盆腔但局限于盆腔内)。随着时间推移，小鼠还出现了超出盆腔边界的腹腔转移结节以及大量腹水，这些特征符合FIGO III期(腹腔内播散)。通过离体成像可以清晰地看到注射侧卵巢和对侧卵巢均发出强烈的生物发光信号，证实了癌细胞在腹腔内的广泛播散能力。因此，该模型在病理学和解剖学上高度还原了人卵巢癌从局部生长到腹腔广泛转移的连续过程，具有很高的临床转化价值。

图 3：AXL在所有ID8传代细胞系中均高表达，但血清GAS6水平在肿瘤进展过程中无显著改变

为明确AXL是否在快速进展的亚系中发生表达变化，作者采用流式细胞术和免疫荧光检测了多个ID8衍生细胞系(包括原始ID8、ID8-fluc、P1、P2、P2 Thy1.1和P3 Thy1.1)表面的AXL蛋白水平。结果显示，所有细胞系均高表达AXL，其中P1 ID8细胞的AXL平均荧光强度显著高于其他所有细胞系，提示第一次体内传代可能通过肿瘤微环境的压力(如缺氧或GAS6信号)短暂上调了AXL表达;而在后续传代中AXL表达回落至与原始细胞相近的水平。免疫荧光图像进一步证实了AXL在细胞膜上的强阳性染色。此外，作者检测了荷瘤小鼠(P3 ID8 Thy1.1)从第1周到第6周的血清GAS6水平，并与同龄健康小鼠进行比较。虽然荷瘤小鼠与健康小鼠在各时间点的血清GAS6浓度总体无显著差异，但在荷瘤小鼠内部，第4周的GAS6水平显著低于第6周。作者推测，第3-4周正是癌细胞从卵巢向腹腔快速播散的时期，此时肿瘤组织内GAS6消耗增加可能导致血清水平暂时性下降，而后期肿瘤负荷增大和基质细胞分泌增加使GAS6水平回升。

图 4：AXL和GAS6的高表达与卵巢癌患者不良预后及铂类化疗耐药密切相关

研究团队利用KM Plotter公共数据库分析了AXL和GAS6 mRNA表达与卵巢癌患者生存期的关联。结果显示，AXL高表达的患者总生存期显著缩短(HR显著>1，p=0.028);GAS6高表达虽然与总生存期的关联未达到统计学显著性(p=0.089)，但与复发-free生存期显著缩短相关(p=0.011)。将AXL和GAS6的平均表达量联合分析时，高表达组患者的总生存期同样显著差于低表达组(p=0.029)。接着，研究团队利用单细胞数据集分析了10例高级别浆液性卵巢癌患者的多种组织样本，发现AXL和GAS6的mRNA在原发性肿瘤和转移性肿瘤中均显著高于外周血单个核细胞、淋巴结和腹水中的表达水平。最后，基于化疗反应的分组热图显示，铂类耐药患者的肿瘤组织中AXL和GAS6的表达水平明显高于铂类敏感患者。这些数据有力地支持了AXL-GAS6信号轴在卵巢癌恶性进展和耐药性中发挥重要作用，也提示靶向该轴可能对铂类耐药患者尤其有效。

图 5：AXL-Fc纳米抗体处理72小时后可诱导P3 ID8 Thy1.1卵巢癌细胞发生坏死

作者从原位接种P3 ID8 Thy1.1细胞6周后的小鼠中取出卵巢肿瘤，制备成单细胞悬液，然后在体外分别加入AXL-Fc或等体积PBS对照，培养24小时或72小时。之后使用流式细胞术检测细胞死亡状态，通过Live/Dead染色和Caspase3/7活性将细胞分为活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和坏死四个群体。结果显示，处理24小时后，AXL-Fc组与对照组在各死亡阶段的细胞比例均无显著差异，说明短时间处理不足以诱导明显的细胞死亡。然而，处理72小时后，AXL-Fc组中Thy1.1阳性癌细胞的坏死比例显著高于PBS对照组(p=0.0099)，而早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例未见明显变化。这表明AXL-Fc主要诱导卵巢癌细胞发生坏死而非凋亡。该发现提示，AXL-Fc通过一种较慢的、非经典的死亡途径发挥抗肿瘤效应，这可能与传统的小分子AXL抑制剂的作用机制有所不同。

图 6：AXL-Fc与奥拉帕尼联合处理在抑制卵巢癌细胞增殖方面表现出协同效应

作者在接种P3 ID8 Thy1.1细胞4周后的小鼠肿瘤单细胞悬液中，分别加入AXL-Fc、奥拉帕尼、AXL-Fc+奥拉帕尼、PBS或DMSO对照，培养72小时后通过流式检测Ki67阳性细胞的百分比以评估增殖情况，同时检测坏死比例。结果显示，与PBS对照组相比，AXL-Fc单药治疗显著降低了增殖中癌细胞的百分比(p=0.0469)，且效果优于奥拉帕尼单药(p=0.0089);而AXL-Fc与奥拉帕尼联合治疗组对增殖的抑制作用显著强于任意一种单药(p<0.0001)，表现出明确的协同效应。在坏死方面，奥拉帕尼单药即可显著诱导坏死，联合治疗并未在奥拉帕尼基础上进一步提高坏死率。研究团队还在HM1小鼠细胞系中重复了实验，联合治疗同样显著增强了坏死(相比于AXL-Fc单药)，但未观察到对增殖的显著影响。作者认为，AXL-Fc在原代肿瘤悬液中的协同作用可能依赖于完整的肿瘤微环境(如免疫细胞或基质细胞产生的GAS6)，而在纯培养的细胞系中则难以复现。

研究结论

本研究成功建立了一种快速进展、高度临床相关的小鼠原位卵巢癌模型(P3 ID8 Thy1.1)，其在42天内模拟人卵巢癌从I期到III期的进展。研究发现，AXL和GAS6在卵巢癌患者中高表达，且与不良预后和铂类耐药相关。新型AXL靶向纳米抗体AXL-Fc在72小时内诱导小鼠卵巢癌细胞坏死，并与PARP抑制剂奥拉帕尼协同抑制癌细胞增殖。尽管在人源性细胞系中未观察到类似协同效应，提示肿瘤微环境的重要性，但该研究为AXL靶向纳米抗体联合PARP抑制剂治疗卵巢癌提供了有力的临床前证据，值得进一步转化研究。