破解乙肝cccDNA持续存在之谜：宿主因子DDB2和Pol δ成新靶点

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：Host Factors DDB2 and DNA Polymerase Delta Are Linked to cccDNA Persistence in Hepatitis B Virus and Occult Hepatitis B Virus-Related Hepatocellular Carcinoma

中文标题：宿主因子DDB2和DNA聚合酶δ与乙型肝炎病毒及隐匿性乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中cccDNA持续存在的关联

发表期刊：《Journal of Viral Hepatitis》

影响因子：2.3

作者单位：

1.Center of Excellence in Kidney-Liver-Microbiota, Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand

2.Department of Surgery, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, King Chulalongkorn Memorial Hospital, Bangkok, Thailand

3.Center of Excellence in Hepatitis and Liver Cancer, Department of Biochemistry, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand

4.Department of Gastroenterology and Hepatology, Faculty of Life Sciences, Kumamoto University, Kumamoto, Japan

作者信息：

作者信息

Kanyakorn Singsung

通讯作者

Natthaya Chuaypen

Pongserath Sirichindakul

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)是病毒在肝细胞核内长期持续存在的储库，也是当前抗病毒治疗无法清除的根本原因。宿主DNA修复因子如DDB2和DNA聚合酶δ(Pol δ)在体外被证实参与cccDNA的形成和维持，但缺乏临床组织样本的验证。隐匿性HBV感染(OBI)定义为血清HBsAg阴性但肝内存在cccDNA，其与肝细胞癌(HCC)的发生密切相关。本研究利用HBV感染的HepG2-NTCP细胞模型敲低DDB2和Pol δ，并在HBV相关HCC(HBV-HCC)和OBI相关HCC(OBI-HCC)患者的肝组织中检测这两种因子的表达，同时通过微滴式数字PCR(ddPCR)精确定量肝内cccDNA，采用高灵敏度iTACT-HBcrAg检测血清HBcrAg作为cccDNA转录活性的替代标志物，旨在验证DDB2和Pol δ在cccDNA持续存在中的临床相关性。

研究方法

作者首先构建了表达NTCP-GFP的HepG2细胞(HepG2-NTCP)，并用pUC19-HBV质粒转染获得HBV感染的HepG2-NTCP细胞(HepG2-NTCP-HBV)。通过siRNA分别敲低DDB2和Pol δ(以scramble siRNA为对照)，Western blot验证敲低效率，采用qPCR定量细胞内总HBV DNA，采用ddPCR定量细胞内cccDNA(经质粒安全ATP依赖DNase酶切富集)。临床研究中，共纳入44例HCC患者(HBV-HCC 23例，OBI-HCC 21例)，收集非肿瘤肝组织和血清。用酚-氯仿法提取肝组织DNA，qPCR检测总HBV DNA，ddPCR检测cccDNA(以RPP30为内参标准化)。Western blot检测肝组织中DDB2和Pol δ蛋白表达，ImageJ条带定量。血清HBcrAg采用全自动LUMIPULSE L2400化学发光酶免疫分析法(iTACT-HBcrAg)检测。统计分析采用Mann-Whitney U检验、Spearman相关性分析等。

实验结果

图1：在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中，siRNA成功敲低DDB2和Pol δ的表达

作者将特异性的siRNA(靶向DDB2或Pol δ)以及乱序对照siRNA转染至HBV感染的HepG2-NTCP细胞中，通过Western blot检测蛋白表达水平。结果显示，与乱序对照组相比，DDB2蛋白条带明显减弱，密度定量分析显示其表达降至对照组的0.43倍(p=0.001);Pol δ蛋白表达降至对照组的0.42倍(p<0.0001)。这表明两种siRNA均能高效敲低目标蛋白，为后续评估这些宿主因子对cccDNA的影响提供了可靠的细胞模型。

图2：敲低DDB2或Pol δ显著降低细胞内HBV DNA和cccDNA水平

在成功敲低DDB2或Pol δ后，作者通过qPCR检测了总细胞内HBV DNA(拷贝/细胞)。结果显示，DDB2敲低组和Pol δ敲低组的HBV DNA水平均显著低于乱序对照组(p分别为0.022和0.023，图2a)。进一步利用ddPCR检测cccDNA(拷贝/反应)，发现两种因子敲低后cccDNA同样显著减少(DDB2敲低组p=0.010，Pol δ敲低组p=0.006，图2b)。这些结果明确支持DDB2和Pol δ参与调控HBV cccDNA的产生和/或稳定，与既往体外研究一致。

图3：HBV-HCC与OBI-HCC患者肝组织中DDB2和Pol δ的表达水平无显著差异

作者通过Western blot检测了两组患者非肿瘤肝组织中DDB2和Pol δ的蛋白表达。DDB2在HBV-HCC组全部23例(100%)中均有表达，在OBI-HCC组21例中的19例(90.48%)中表达，两组间表达水平无统计学差异(p=0.116，图3a)，仅OBI组呈下降趋势。Pol δ在HBV-HCC组中仅在6/23例(26.09%)可检测到，在OBI-HCC组中17/21例(80.95%)可检测到，但整体表达水平两组间也无显著差异(p=0.474，图3b)。这表明即使OBI状态下病毒复制极低，但宿主DNA修复因子仍可能被保留表达。

图4：OBI-HCC患者肝内病毒标志物显著低于HBV-HCC，且血清HBcrAg检出率更低

尽管宿主因子表达相似，但肝内病毒载量存在巨大差异。qPCR显示，HBV-HCC组肝内总HBV DNA中位数为0.28拷贝/细胞，远高于OBI-HCC组的0.06拷贝/细胞(p<0.0001，图4a)。ddPCR检测cccDNA同样显示，HBV-HCC组中位数为4.8拷贝/反应，OBI-HCC组仅为1.2拷贝/反应(p<0.0001，图4b)。血清HBcrAg(≥2.1 LogU/mL为阳性)在HBV-HCC组中检出率高达91.3%(21/23)，而在OBI-HCC组中仅23.8%(5/21)(p<0.001，图4c)。这说明OBI状态下cccDNA虽仍存在，但其转录活性被高效抑制。

图5：DDB2表达与肝内HBV DNA和cccDNA呈正相关，但在OBI中与血清HBcrAg无显著相关性

在HBV-HCC组(n=23)，DDB2表达与肝内总HBV DNA(r=0.885，p<0.0001，图5a)、cccDNA(r=0.725，p<0.0001，图5b)以及血清HBcrAg(r=0.750，p<0.001，图5c)均呈强正相关。在OBI-HCC组(n=19)，DDB2表达仍与肝内HBV DNA(r=0.712，p<0.001，图5d)和cccDNA(r=0.595，p=0.007，图5e)显著正相关，但与血清HBcrAg无显著相关性(r=0.633，p=0.500，图5f)，这可能是由于OBI组中仅有少数患者HBcrAg可检出，限制了统计效力。这些结果提示DDB2主要参与cccDNA的物理持续存在，而非直接驱动其转录。

研究结论

本研究首次整合体外细胞模型与临床肝组织样本，证实了宿主DNA修复因子DDB2和DNA聚合酶δ在HBV cccDNA维持中的关键作用。在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中敲低这两个因子可显著降低cccDNA和总HBV DNA水平。在HBV-HCC和OBI-HCC患者中，虽然OBI组肝内病毒标志物和血清HBcrAg水平极低，但DDB2和Pol δ的表达仍与HBV-HCC组相当，且DDB2表达与肝内cccDNA呈正相关，提示这些宿主因子支持cccDNA的持续存在而不一定驱动其转录。血清HBcrAg在OBI中几乎检测不到，反映了cccDNA的表观遗传或免疫沉默状态。因此，靶向DDB2或Pol δ及其相关DNA修复途径可能是清除或永久沉默cccDNA、实现HBV功能性治愈的潜在治疗策略，对慢性和隐匿性HBV相关HCC均有意义。