VISTA⁺滤泡调节性 T 细胞调控效应免疫细胞功能：卵巢癌免疫逃逸的新机制

研究背景

卵巢癌肿瘤微环境中效应免疫细胞功能障碍是免疫逃逸的核心驱动因素。VISTA 作为 B7 家族新型免疫检查点，与 PD-1/CTLA-4 机制不同，可直接抑制 T 细胞激活或调控抗原呈递细胞功能，但在卵巢癌中的具体作用尚不明确。Tfr 细胞作为连接细胞与体液免疫的关键调控细胞，高表达免疫检查点分子，但其是否通过 VISTA 调控效应免疫细胞功能参与卵巢癌免疫逃逸，仍缺乏明确实验证据。

来自新疆医科大学第三临床医学院(附属肿瘤医院)的团队在《Frontiers in Immunology》上发表的这篇VISTA⁺ follicular regulatory T cells modulate the function of effector immune cells: implications for ovarian cancer immune escape的文章，构建 VISTA 过表达 / 沉默 Tfr 细胞模型，通过体外共培养实验，明确 VISTA⁺Tfr 细胞对 CD8⁺T 细胞、CD4⁺CD25⁻T 细胞及 B 细胞的调控作用，揭示其在卵巢癌免疫逃逸中的关键角色，为 VISTA 靶向免疫治疗提供理论支撑。

实验方法

1.细胞分离与培养：从健康人外周血分离 PBMCs，通过磁珠分选和流式分选获得 naive CD4⁺T 细胞、CD8⁺T 细胞、CD4⁺CD25⁻T 细胞及 B 细胞;诱导 naive CD4⁺T 细胞分化为 FOXP3⁺CXCR5⁺Tfr 细胞，流式分选 VISTA⁺Tfr 和 VISTA⁻Tfr 细胞。

2.VISTA 过表达 / 沉默 Tfr 细胞构建：采用慢病毒载体(pLVX-VISTA-IRES-ZsGreen1 过表达载体、pLVX-shVISTA-IRES-Puro 沉默载体)转染 Tfr 细胞，设置空白对照、阴性对照和靶向干预组，验证转染效率(约 80%)后用于后续实验。

3.细胞增殖 assay：采用 CFSE 染色法，将不同处理组 Tfr 细胞与 CD8⁺T 细胞、CD4⁺CD25⁻T 细胞或 B 细胞按 4:1 比例共培养 5 天，流式细胞术检测 CFSE 荧光强度，评估增殖能力。

4.ELISA 检测：收集共培养上清，检测 CD8⁺T 细胞相关细胞因子(IL-2、IFN-γ、颗粒酶 B、穿孔素)、CD4⁺CD25⁻T 细胞相关细胞因子(IL-1α、IL-2、TNF-α)及 B 细胞分泌的抗体(IgA、IgE、IgM、IgG)水平。

5.流式细胞术分析：检测 CD8⁺T 细胞激活标志物(CD69)及耗竭分子(PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM-3)表达;通过胞内染色检测 CD4⁺CD25⁻T 细胞向 Th1(IFN-γ⁺)、Th2(IL-4⁺)、Th17(IL-17⁺)的分化比例。

6.统计分析：使用 SPSS 19.0 软件，正态分布数据以均数 ± 标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，非正态分布数据采用 Kruskal-Wallis H 检验，p<0.05 为差异有统计学意义。

关键结果

1. VISTA 增强 Tfr 细胞对 CD8⁺T 细胞的抑制作用

VISTA⁺Tfr 细胞共培养组 CD8⁺T 细胞 CFSE 荧光衰减比例显著低于 VISTA⁻Tfr 组(p<0.01);VISTA 过表达进一步降低 CD8⁺T 细胞增殖，沉默则促进增殖。ELISA 结果显示，VISTA⁺Tfr 组 CD8⁺T 细胞分泌 IL-2、IFN-γ、颗粒酶 B、穿孔素水平显著降低(p<0.05)，沉默 VISTA 后上述细胞因子水平回升。

2. VISTA 调控 CD8⁺T 细胞激活表型与耗竭分子表达

VISTA⁺Tfr 细胞共培养组 CD8⁺CD69⁺细胞比例显著下降(p<0.01)，CD8⁺PD-1⁺、CD8⁺CTLA-4⁺细胞比例显著升高(p<0.05)，LAG3、TIM-3 表达无显著差异;VISTA 过表达加剧该表型，沉默则逆转 CD69 下调和 PD-1 上调。

3. VISTA 增强 Tfr 细胞对 CD4⁺CD25⁻T 细胞的抑制作用

VISTA⁺Tfr 组 CD4⁺CD25⁻T 细胞增殖速率显著低于 VISTA⁻Tfr 组(p<0.01)，VISTA 过表达增强增殖抑制，沉默则减弱。共培养上清中 IL-1α、IL-2、TNF-α 水平在 VISTA⁺Tfr 组显著降低(p<0.05)，沉默 VISTA 后促炎因子水平升高。

4. VISTA 诱导 CD4⁺CD25⁻T 细胞向 Th2 分化

VISTA⁺Tfr 组 CD4⁺IFN-γ⁺(Th1)、CD4⁺IL-17⁺(Th17)细胞比例显著降低(p<0.05)，CD4⁺IL-4⁺(Th2)细胞比例显著升高(p<0.01);VISTA 过表达强化 Th2 偏向分化，沉默则促进 Th1/Th17 分化。

5. VISTA⁺Tfr 细胞选择性抑制 B 细胞 IgE 分泌

VISTA⁺Tfr 细胞对 B 细胞增殖无显著影响，但共培养上清中 IgE 水平显著低于 VISTA⁻Tfr 组(p<0.01);VISTA 过表达进一步降低 IgE 分泌，沉默则升高，IgA、IgM、IgG 分泌无显著组间差异。

全文总结

本研究首次明确 VISTA⁺Tfr 细胞通过多维度调控效应免疫细胞功能参与卵巢癌免疫逃逸：对 CD8⁺T 细胞发挥增殖抑制、细胞因子分泌阻滞及耗竭诱导作用，削弱核心抗肿瘤细胞毒性;通过重塑 Th 细胞亚群平衡(Th2 偏向)降低促炎免疫应答;特异性抑制 IgE 分泌，间接影响肿瘤微环境炎症状态。这些调控具有 “细胞选择性”，可能与不同免疫细胞表面 VISTA 受体(如 PSGL-1、VSIG3)的差异表达相关。研究揭示 VISTA-Tfr 细胞轴是卵巢癌免疫逃逸的关键机制，为临床开发 VISTA 靶向治疗提供实验依据，联合 PD-1/CTLA-4 抑制剂可能进一步增强抗肿瘤免疫效果，为卵巢癌免疫治疗提供新策略。