5 周快速构建富含星形胶质细胞的脑类器官！这款纯化方法解决研究关键难题

人类多能干细胞(hPSC)衍生的原始神经祖细胞(pNPC)和脑类器官，是研究人类脑发育的核心工具，但长期面临两大挑战：一是难获得高纯度 pNPC(易混杂分化细胞)，二是脑类器官中星形胶质细胞生成慢、占比低，限制神经 - 胶质相互作用研究。

近期，美国罗格斯大学的团队，在《STAR Protocols》上发表题为 “Protocol for purifying primitive neural progenitors by fractional passaging to generate astroglia-enriched cerebral organoid” 的研究。他们提出分步传代法，5 周内既实现 > 98% 纯度的 SOX2+/PAX6+ pNPC 纯化，又构建出含 15% 以上星形胶质细胞的脑类器官，为相关研究提供高效方案。

实验方法

本研究核心流程分 4 步，全程使用化学成分明确的培养基，确保可重复性：

1.hPSC 分化为神经玫瑰花结(耗时 2 周)

用 mTeSR Plus 培养基在 Matrigel 包被板中培养 hPSC，通过 ReLeSR 试剂将 hPSC 解离为 > 200μm 的团块，接种到超低吸附板;

加入 CEPT 化合物(提升细胞活力)和神经 EB 培养基，每日换液培养 7 天;

后续转移至 Matrigel 包被的 60mm 皿，用神经玫瑰花结培养基每 2 天换液，再培养 7 天形成神经玫瑰花结。

2.神经玫瑰花结筛选与解离(耗时 1-2 周)

显微镜下用火焰拉制的玻璃吸管，手动筛选神经玫瑰花结(避免过度破碎)，转移至离心管并用 DMEM/F12 清洗 3 次;

加入 TrypLE 在 37℃孵育 6-8 分钟，解离后计数，以 1-2×10^6 细胞 / 孔接种到 Matrigel 包被的 6 孔板，用 pNPC 培养基培养，每 2 天换液。

3.pNPC 分步传代纯化(耗时 30 分钟)

待 pNPC 培养至 100% 汇合且需每日换液时，加入 1mL TrypLE，轻敲培养板使非 pNPC 细胞脱落(pNPC 仍贴壁);

清洗后再加入 TrypLE 孵育 4-6 分钟，解离 pNPC，以 1×10^6 细胞 / 孔接种到新板，可重复纯化以提升纯度至 > 98%。

4.构建富含星形胶质细胞的脑类器官(耗时 5 + 周)

第 0 天：在超低吸附 96 孔板中，每孔接种 10,000 个 pNPC，用含 CEPT 的 NPC 培养基培养 3 天;

第 3-14 天：转移至超低吸附 6 孔板，用 NPC 培养基每 2 天换液，第 8 天起置于 80rpm 摇床培养;

第 14-35 天：换用含 BMP4 的 N-AD 培养基(促进星形胶质细胞分化)，每 2 天换液，第 35 天为主要终点，可延长至 6-8 周提升神经元成熟度。

关键结果

图1：pNPC 分化与纯化的时间线及形态特征

该图清晰展示从 hPSC 到纯化 pNPC 的完整流程：hPSC 先形成神经 EB(第 0-7 天)，再分化为神经玫瑰花结(第 7-14 天)，经分步传代后(第 17-20 天)，pNPC 形成紧密的 “网状” 集落或玫瑰花结结构。图中还标注了各阶段关键培养基(如神经 EB 培养基含 SB431542，pNPC 培养基含 bFGF)，明确每步操作的时间节点，为实验重复提供直观参考。

图2：pNPC 纯化前后的纯度验证

通过免疫荧光和定量分析，证实分步传代法的纯化效果：纯化前 SOX2+/PAX6+ pNPC 比例低(部分细胞系 <20%)，纯化后纯度显著提升至> 98%(Student’s t-test，p<0.001)。同时，纯化后的 pNPC 高表达 Nestin(神经祖细胞特异性标记)，且能稳定形成玫瑰花结结构，证明其原始神经上皮特性未丢失。

图3：富含星形胶质细胞脑类器官的鉴定

对比对照组与 BMP4 处理组(N-AD 培养基)，结果显示：BMP4 处理使类器官中星形胶质细胞标记(CD44、S100β)阳性率从 < 5% 升至～15%，且细胞分支更复杂;同时神经元成熟度提升，未成熟神经元标记 DCX 降低，成熟神经元标记 NeuN 从～15% 升至 30%(两尾 t-test，p<0.01 或 p<0.001)，说明该方法可同步促进星形胶质细胞生成与神经元成熟。

图4：类器官中星形胶质细胞的量化分析

进一步验证星形胶质细胞的富集效果：免疫荧光显示类器官中 CD44+、S100β+ 及 GFAP+(成熟星形胶质细胞标记)细胞分布均匀;定量数据表明，CD44 + 和 S100β+ 细胞占比稳定在 15% 以上，GFAP + 细胞的分支数量和平均长度较对照组显著增加，证实星形胶质细胞不仅数量达标，且形态功能成熟。

全文总结

本研究提出的 “分步传代纯化 pNPC+BMP4 诱导星形胶质细胞” 方案，解决了 hPSC 衍生神经祖细胞纯度低、脑类器官星形胶质细胞生成慢的核心痛点。全程仅需 5 周，即可获得 > 98% 纯度的 SOX2+/PAX6+ pNPC，以及含 15% 以上成熟星形胶质细胞的脑类器官，且神经元成熟度同步提升，较传统 8-12 周的方法大幅缩短时间。

该系统采用化学成分明确的培养基，具有可扩展性和可重复性，为研究人类神经 - 胶质相互作用、构建神经疾病模型(如自闭症、阿尔茨海默病)提供高效工具。但需注意，实验依赖 hPSC 初始质量，且需严格无菌操作和稳定培养条件，后续可进一步优化以适应更多遗传背景的细胞系。