突破肝类器官免疫细胞缺失难题！人 iPSC 衍生含库普弗细胞肝类器官（KuLOs）方案解读

肝类器官是研究肝脏发育与疾病的重要模型，但传统模型因缺乏肝脏驻留巨噬细胞(库普弗细胞)，难以模拟真实肝脏的免疫调节与炎症响应功能。此前方法虽尝试整合库普弗细胞，却因造血谱系分化效率低，导致库普弗细胞占比有限、功能不成熟。

近期，英国剑桥大学杨莉(Yang Li)、日本东京大学聂运忠(Yunzhong Nie)及谷口英树(Hideki Taniguchi)团队，在《STAR Protocols》上发表题为 “Protocol for generating liver organoids containing Kupffer cells using human iPSCs(利用人诱导多能干细胞生成含库普弗细胞的肝类器官的方案)” 的研究。该研究建立高效流程，从人 iPSC 分化出红系 - 髓系祖细胞(EMPs，库普弗细胞前体)与肝内胚层(HE)，再与 iPSC 衍生的内皮细胞(ECs)、间充质细胞(MCs)共培养，14 天内生成含功能性库普弗细胞的肝类器官(KuLOs)，为肝脏炎症与损伤研究提供新平台。

实验方法

本研究核心流程分 5 阶段，全程使用化学成分明确的培养基，确保库普弗细胞高效整合与肝类器官功能成熟，具体步骤如下：

1.人 iPSC 培养准备(耗时 2 周)

培养基制备：将 iMatrix-511 按 14μL/2mL PBS 稀释，包被 6 孔板(1 孔 / 2mL)，37℃孵育 1 小时;StemFit AK02N 培养基添加组分 B/C，补加 10μM Y-27632(仅首 24 小时使用)。

细胞复苏与传代：iPSC 冻存管 37℃水浴解冻后，用 7mL RPMI1640 洗涤，200g 离心 4 分钟;以 4×10⁴细胞 / 孔接种到包被板，第 1、3、5 天换 2mL AK02N 培养基，第 6 天换 3mL，第 7 天用 Accutase 解离传代(70%-80% 汇合时)，推荐使用 < 28 代的 iPSC。

2.iPSC 分化为 EMPs(库普弗细胞前体，耗时 12 天)

第 0 天(分化启动)：12 孔板用 iMatrix-511 包被后，每孔接种 300 个 iPSC，培养 4 天至形成分散集落，换用EMP 分化培养基 A(含 Wnt-3a、bFGF、VEGF、BMP4)。

第 2 天：半量换液(弃 500μL 旧液，加 500μL 新鲜培养基 A)。

第 3 天：全量换用EMP 分化培养基 B(含 VEGF、bFGF、SCF、TPO、Flt3L)。

第 5 天：半量换液(同第 2 天)，流式检测中胚层祖细胞(KDR⁺CD34⁺)比例。

第 7 天：全量换新鲜培养基 B，移除前 7 天产生的悬浮细胞(减少异质性)。

第 8-10 天：收集贴壁细胞表面 budding 的圆形造血细胞，300g 离心 5 分钟，DMEM 洗涤后计数，流式验证 EMP 标记(CD43⁺CD34⁺CD115⁺)，细胞冰上保存备用。

3.iPSC 分化为肝内胚层(HE，耗时 10 天)

第 0 天(分化启动)：10cm 皿用 iMatrix-511 包被后，接种 5×10⁶个 iPSC，使用含 2μM CHIR99021、10μM Y-27632 的定形内胚层(DE)分化基础培养基。

第 1-2 天：换用含 2μM CHIR99021、500μM 丁酸钠(NaB)的 DE 培养基。

第 3 天：换用含 500μM NaB 的 DE 培养基。

第 4 天：换用纯 DE 培养基，培养 24 小时。

第 5-10 天：每日换用HE 分化培养基(含非必需氨基酸、DMSO、谷氨酰胺)，第 10 天用 0.05% 胰酶 - EDTA 解离，200g 离心 4 分钟，DMEM 洗涤后计数，流式验证 HE 标记(CD326⁺EpCAM⁺CD133⁺)，细胞冰上保存备用。

4.共培养生成 KuLOs(耗时 14 天)

第 0 天(共培养启动)：24 孔 Corning Elplasia U 型底板(超低吸附)每孔加 500μL PBS，1800g 离心 1 分钟;按比例(HE:ECs:MCs:EMPs=5:1:1:1)接种细胞(每孔含 2.5×10⁵ HE、5×10⁴ ECs、5×10⁴ MCs、5×10⁴ EMPs)，用含 10μM Y-27632 的KuLO 培养基(DMEM+KBM-VEC1 基础培养基 + 0.5% FBS+Dexamethasone+OSM+M-CSF)重悬，每孔加 500μL 细胞悬液，37℃培养 6 小时形成细胞球。

第 1 天：全量换用不含 Y-27632 的 KuLO 培养基，从孔顶端缓慢吸弃旧液(4-6 秒 / 500μL)，再缓慢加 1mL 新液(6-8 秒 / 1mL)。

第 3-14 天：每 2 天换液 1 次，第 4、7、10、14 天收集培养基，用 ELISA 检测白蛋白分泌(评估肝功能成熟度)。

5.KuLOs 鉴定(耗时 1-3 天)

流式分析：收集培养基上清(含游离造血细胞)与解离的类器官单细胞(用 Accumax 解离 20 分钟)，检测库普弗细胞标记(CD45⁺CD14⁺CD163⁺)及肝细胞标记(CD326⁺)。

全 mount 免疫染色：类器官用 4% 多聚甲醛固定 1 小时，OWB 缓冲液透化封闭，加一抗(HNF4α 标记肝细胞、CD68 标记库普弗细胞)4℃孵育过夜，二抗室温孵育 3 小时，CUBIC-R + 透明化后，共聚焦显微镜 z-stack 成像。

关键结果

图1：iPSC 分化与 KuLOs 生成的时间线

该图明确各阶段时间节点与细胞准备逻辑：iPSC 需分两批培养 —— 第一批用于 EMP 分化(第 0-12 天)，第二批用于 HE/ECs/MCs 分化(第 0-10 天)，最终在第 26 天汇合共培养，14 天后(第 40 天)获得成熟 KuLOs。时间线清晰标注各阶段关键培养基与操作(如 EMP 分化第 3 天换培养基 B、HE 分化第 5 天换 HE 培养基)，为实验重复提供精准参考。

图2：iPSC 衍生 EMPs 的分化效率验证

通过形态观察与流式分析，证实 EMP 分化的有效性：第 0 天 iPSC 形成稀疏集落，第 5 天出现贴壁细胞表面的小细胞簇(造血前体)，第 8 天可见圆形造血细胞 budding(图 2B);流式结果显示，第 3 天中胚层祖细胞(KDR⁺CD34⁺)比例达 9.3±1.1%，第 5 天升至 21.8±8.6%(图 2C)，第 8-10 天 EMP(CD43⁺CD34⁺CD115⁺)比例稳定，确保库普弗细胞前体的充足供应(图 2D)。

图3：iPSC 衍生 HE 的分化效率验证

形态与分子水平证实 HE 分化成功：第 1 天 iPSC 呈密集分布，第 5 天细胞形态拉长(定形内胚层特征)，第 10 天出现多边形、边界清晰的 HE 细胞(图 3B);流式显示第 10 天 HE 标记(EpCAM⁺CD133⁺)比例 > 95%，DE 标记(CXCR4⁺)低表达(图 3C);qRT-PCR 结果显示，分化过程中多能性基因(NANOG、POU5F1)下调，DE 基因(CXCR4、CER1)先升后降，HE 基因(HNF4A、AFP)显著上调(图 3D)，证明 HE 的正确分化。

图4：KuLOs 的形态与功能鉴定

验证 KuLOs 的结构完整性与功能性：共培养第 1 天形成紧密细胞球，第 6-14 天类器官体积增大，周围造血细胞显著扩增(图 4A);流式显示第 14 天库普弗细胞(CD45⁺CD14⁺CD163⁺)比例 > 90%(图 4B);全 mount 免疫荧光显示，类器官内 HNF4α⁺肝细胞与 CD68⁺库普弗细胞分布均匀，证实库普弗细胞成功整合(图 4C);此外，第 12-14 天白蛋白分泌稳定，库普弗细胞高表达抗原处理、铁离子稳态相关基因，证明 KuLOs 兼具肝细胞功能与库普弗细胞免疫特性。

全文总结

本研究建立的 “iPSC 分化 - 多细胞共培养” 方案，解决了传统肝类器官缺乏功能性库普弗细胞的核心痛点。通过分阶段诱导 EMPs(库普弗前体)与 HE，再与 ECs、MCs 共培养，14 天内即可生成含 > 90% 纯度库普弗细胞的 KuLOs，且类器官白蛋白分泌稳定、库普弗细胞功能成熟(可响应内毒素刺激释放炎症因子)。