人肾上腺皮质类器官：组织再生与疾病建模的新工具

肾上腺皮质是维持激素稳态的核心，其分泌的糖皮质激素(如皮质醇)不足会导致肾上腺功能不全，现有激素替代疗法易引发高血压、肥胖等副作用，而动物模型因物种差异(如小鼠肾上腺无 CYP17A1，不产皮质醇)、传统 2D 细胞模型缺乏器官结构，难以满足研究与治疗需求。

南昌大学与复旦大学团队在《Stem Cell Reports》上发表题为Human adrenocortical organoids for tissue regeneration and disease modeling的研究，首次建立可扩增的人肾上腺皮质类器官(ACO)模型：从成人肾上腺组织消化获得细胞，悬浮培养形成类器官，主要含束状带(zF)细胞，能响应 ACTH 分泌皮质醇(最高达 5449.7nmol/L);皮下移植可拯救肾上腺切除小鼠(生存率提升至 83%)，且通过引入 PRKACA L206R 突变(库欣综合征热点突变)，成功建模皮质醇分泌腺瘤。该模型为肾上腺功能不全的细胞治疗及肾上腺疾病机制研究提供关键工具。

实验方法

1. 人肾上腺皮质类器官(ACO)的构建与培养

组织处理：取成人肾上腺肿瘤旁正常组织(n=5)，剪碎后用胶原酶 I(1000U/mL)37℃消化 30 分钟，10% FBS 中和，70μm 滤网过滤获原代细胞。

培养条件：3×10⁴细胞 / 孔接种于低吸附 24 孔板(Pluronic F-127 涂层防黏附)，ACO 培养基含 Advanced DMEM/F12、B27、WNT3A(200ng/mL)、EGF(50ng/mL)等关键因子，37℃、5% CO₂培养，每 3 天换液，传代比例 1:3(P0-P3 扩增快，可维持 3 个月以上)。

优化验证：对比悬浮培养与 Matrigel 包埋，悬浮培养细胞存活率高(Matrigel 培养传代时细胞损失超 60%);去除 WNT3A 或 EGF 会导致 ACO 无法形成，FGFs(FGF2/7/10)缺失会破坏结构完整性。

2. ACO 的细胞与分子鉴定

单细胞测序：取 P2 ACO 进行 10× Genomics 单细胞测序，参考人肾上腺单细胞数据库，分析细胞类型及标志物表达(zF：CYP11B1⁺STAR⁺;zG：CYP11B2⁺;zR：CYB5A⁺)。

免疫荧光：用 NR5A1(皮质细胞标志物)、CYP11B1(zF)、CYP11B2(zG)、SULT2A1(zR)抗体染色，DAPI 染核，共聚焦显微镜观察细胞组成。

激素检测：质谱(MS)分析 ACO 培养上清，定量皮质醇、醛固酮等类固醇激素，验证分泌功能。

3. ACTH 刺激实验

处理分组：P2 ACO 分为对照组(常规培养基)和 ACTH 组(加 10nM ACTH₁₋₃₉)，培养 48 小时。

检测指标：RNA 测序分析差异基因(DEGs)，qPCR 验证类固醇合成(STAR、CYP11B1)和 cAMP 通路基因(PRKACA)表达;MS 检测上清中激素浓度变化。

4. 动物移植实验

皮下移植：NSG 小鼠分为原代肾上腺细胞组和 ACO 组(P0/P2)，将细胞与凝血酶 - 纤维蛋白原混合形成凝块，移植于腋下皮下，1 个月后取移植物行 H&E 和免疫荧光检测，测血清激素。

肾上腺切除拯救实验：小鼠分为 4 组(n=8 / 组)：正常 + ACO、肾上腺切除(AI)、AI+ACO、AI + 地塞米松，监测 30 天生存率、体重，6 天后取脾、肾等靶器官行病理分析，测血清皮质醇 / 皮质酮。

5. 库欣综合征疾病建模

突变导入：慢病毒载体构建 PRKACA L206R 突变体，转染 P1 ACO，嘌呤霉素筛选阳性克隆(对照组转染 GFP)。

功能验证：qPCR 检测 PRKACA 和 STAR 表达，显微镜观察类器官面积变化;RNA 测序分析 DEGs，MS 检测激素分泌，验证是否模拟皮质醇分泌腺瘤特征。

关键结果

图1：人肾上腺皮质类器官(ACO)的构建与鉴定

该图奠定 ACO 构建基础：A 为 ACO 制备流程，原代细胞悬浮培养形成类器官;B 为明场图，P0-P5 ACO 呈球形，直径 50-150μm，P3 后扩增减缓但形态稳定;C 为细胞扩增定量，P0-P3 细胞数增长超 10 倍(P3 达峰值，约 1.2×10⁵细胞 / 孔);D 为 H&E 染色，ACO 细胞排列紧密，类似人肾上腺皮质结构，无髓质成分;E 为电镜，ACO 细胞含丰富内质网、线粒体和脂滴(zF 细胞典型特征);F-K 为免疫荧光，ACO 主要含 NR5A1⁺皮质细胞(占比超 80%)，CYP11B1⁺zF 细胞占比最高(约 70%)，CYP11B2⁺zG 细胞(<10%)和 SULT2A1⁺zR 细胞(<5%)极少，无 CHGA⁺髓质细胞。结果证实 ACO 以功能型 zF 细胞为主，结构符合肾上腺皮质特征。

图2：单细胞测序解析 ACO 细胞组成与激素分泌

该图明确 ACO 的细胞异质性与功能：A 为 UMAP 图，鉴定出 9 种细胞类型(zF/zG/zR、内皮细胞等)，皮质细胞占比 75%;B 为 zF/zG 标志物表达，CYP11B1 在 zF 高表达，CYP11B2 仅在少量 zG 中表达;C-D 为 ACO 与成人肾上腺组织单细胞数据整合，ACO 缺失祖细胞和髓质细胞簇，其余细胞类型与组织相关性达 0.85;E 为激素谱，ACO 分泌高浓度皮质醇(4138.8-5449.7nmol/L)和皮质酮，醛固酮低(12.4-14.8nmol/L)，儿茶酚胺未检出;F-G 为 LGR5 与 PCNA 表达，ACO 含 LGR5⁺PCNA⁻(静息干细胞)、LGR5⁻PCNA⁺(增殖细胞)和 LGR5⁺PCNA⁺(增殖干细胞)，LGR5 表达与 ACO 集落形成效率正相关(r=0.78)。结果表明 ACO 保留肾上腺皮质核心功能，LGR5⁺细胞可能驱动增殖。

图3：ACTH 刺激增强 ACO 成熟与皮质醇分泌

该图验证 ACO 的生理响应性：A 为实验设计，ACTH 处理激活皮质醇合成通路;B-C 为热图，ACTH 组 cAMP 通路(PRKACA、CREB)和类固醇合成基因(STAR、CYP11B1)显著上调(log₂FC>2);D-E 为 GSEA 分析，ACTH 组 “皮质醇生成” 和 “cAMP 信号” 通路富集评分超 1.5;F 为 qPCR 验证，CYP11B1 表达上调 4.3 倍，PRKACA 上调 2.8 倍;G 为激素定量，ACTH 组皮质醇浓度是对照组 10.9 倍，皮质酮 1.3 倍，醛固酮无显著变化。结果证实 ACO 能响应生理刺激，高效合成糖皮质激素。

图4：ACO 移植优于原代细胞，可在体内分泌激素

该图对比移植效果：A 为移植流程，细胞 - 凝块复合物皮下移植;B 为移植物照片，ACO 组移植物体积(约 2mm³)是原代细胞组(<0.5mm³)4 倍;C 为 H&E 染色，ACO 移植物含大量 zF 样细胞，原代细胞组仅残留少量细胞且巨噬细胞浸润多;D-E 为免疫荧光，ACO 移植物 CYP11B1⁺细胞占比(62%)显著高于原代组(8%，p<0.001)，且 Ki67⁺增殖细胞更多;F-G 为细胞计数，原代细胞移植后数量减少 60%，ACO 数量增加 2.3 倍;H 为血清激素，ACO 移植小鼠血清人皮质醇达 0.1-0.3ng/mL，原代组未检出。结果表明 ACO 移植后存活和功能维持能力远超原代细胞。

图5：ACO 移植拯救肾上腺切除小鼠

该图验证 ACO 的治疗潜力：A 为生存曲线，AI 组小鼠 9 天内全部死亡，AI+ACO 组 30 天生存率 83%(AI + 地塞米松组 83%);B 为体重变化，AI 组体重持续下降(30 天降 20%)，AI+ACO 组初始 3 天降 5% 后回升;C 为心率，AI 组心率显著升高(>600 次 / 分)，ACO 移植后恢复至正常水平(450-500 次 / 分);D-E 为血清激素，AI+ACO 组人皮质醇达 2.4nmol/L，小鼠皮质酮降至正常范围;F-H 为靶器官病理，AI 组脾淋巴细胞增殖减少(Ki67⁺细胞占比降 50%)、肾 tubule 凋亡增加(caspase-3⁺细胞增 3 倍)，ACO 移植可逆转这些异常。结果证实 ACO 能恢复激素稳态，拯救肾上腺功能不全。

图6：PRKACA L206R 突变建模皮质醇分泌腺瘤

该图实现疾病建模：A 为实验设计，慢病毒转染导入突变;B 为荧光图，PRKACA L206R 组 GFP⁺类器官数量更多;C 为面积定量，突变组类器官面积(约 5×10⁴μm²)是对照组(2×10⁴μm²)2.5 倍;D 为 qPCR，PRKACA 表达上调 3.2 倍，STAR 上调 4.1 倍;E 为热图，突变组 AC 腺瘤特征基因(HES6、STARD4)显著上调;F 为激素定量，突变组皮质醇分泌是对照组 20 倍，醛固酮 7.2 倍，雄激素(雄烯二酮)21.1 倍。结果表明 ACO 可模拟库欣综合征的病理特征，为疾病机制研究提供模型。

全文总结

本研究首次建立可扩增的成人肾上腺皮质类器官模型，核心发现如下：1)ACO 以 zF 细胞为主，能响应 ACTH 高效分泌皮质醇，P0-P3 扩增能力强，可维持 3 个月以上;2)皮下移植 ACO 的存活和功能优于原代细胞，能在体内分泌激素，且可拯救肾上腺切除小鼠，逆转靶器官损伤;3)导入 PRKACA L206R 突变后，ACO 表现出皮质醇分泌腺瘤特征，成功实现疾病建模。