突破肝纤维化模型局限！TP53 敲除 iPSC 肝类器官精准模拟人类肝纤维化进程

肝纤维化是慢性肝病进展为肝癌的关键阶段，核心特征是细胞外基质(ECM)过度沉积，但现有研究受两大瓶颈制约：一是小鼠模型难以复刻人类生理特征，二是缺乏能模拟早期纤维化的体外模型，导致候选药物转化价值低。人诱导多能干细胞(iPSC)衍生肝类器官(eHEPOs)虽具潜力，却未整合关键驱动基因缺陷，无法模拟纤维化的基因 - 微环境互作机制。

近期，土耳其 Dokuz Eylul 大学 Izmir 生物医学与基因组中心 Mustafa Karabicici、Esra Erdal 团队，在《Molecular Oncology》上发表题为 “Modeling hepatic fibrosis in TP53 knockout iPSC-derived human liver organoids(在 TP53 敲除 iPSC 衍生人肝类器官中模拟肝纤维化)” 的研究。该团队通过 CRISPR/Cas9 构建TP53 敲除肝类器官(TP53KO-eHEPOs)，结合促纤维化微环境(pf-DM)，成功复现人类肝纤维化病理特征与分子通路，同时检测到早期肝癌标志物升高，为相关研究提供 “基因缺陷 + 微环境” 双调控模型。

实验方法

TP53KO-eHEPOs 构建与筛选：用 CRISPR/Cas9 靶向 TP53 第 4 外显子引入移码突变，将 gRNA 转入 iPSC 后诱导分化为肝类器官;用 Nutlin-3a 筛选抵抗凋亡的敲除克隆，通过 Western blot、免疫组化验证 P53 蛋白缺失，选择增殖能力强的 B4 克隆用于后续实验。

促纤维化微环境(pf-DM)制备：用 10ng/mL TGF-β1 激活 LX2 肝星状细胞，收集 48 小时分泌组;用 200ng/mL PMA 诱导 THP-1 细胞分化为巨噬细胞，再用 25ng/mL IL-4 诱导 M2 极化，收集 48 小时分泌组;将两种分泌组各按 15% 比例混入分化培养基，制成 pf-DM。

关键检测：用 Ki67 染色、Cell-Titer-Glo 检测增殖，白蛋白 ELISA、PAS 染色验证肝细胞功能;qPCR 检测 COL1A1/COL3A1/PDGFRB 等纤维化标志物，Masson 三色染色观察胶原沉积;RNA-seq 分析差异基因，TCF/LEF、pSBE4luc 报告基因检测 Wnt、TGF-β 通路活性。

关键结果

图1：TP53KO-eHEPOs 模型构建与验证

该图证实模型构建成功：Nutlin-3a 筛选后获得 B4 克隆，免疫组化显示 B4 克隆 P53 蛋白完全缺失，Ki67 阳性细胞比例较野生型显著升高;Western blot 进一步确认 P53 表达消失，且 B4 克隆能稳定形成类器官，增殖能力符合后续实验需求。

图2：TP53KO-eHEPOs 的增殖与分化特性

结果显示 TP53 缺失可调控类器官增殖与分化：在扩增培养基中，TP53KO 类器官增殖信号是野生型的 1.5 倍;切换至分化培养基或 pf-DM 后，增殖减弱但分化增强，pf-DM 处理后白蛋白分泌量较野生型高 30%，PAS 染色显示糖原储存能力提升，免疫荧光证实肝细胞标志物(ALB、A1AT)表达上调。

图3：TP53KO-eHEPOs 的转录组纤维化特征

RNA-seq 分析显示，TP53KO 类器官与野生型相比，共 623 个基因上调、710 个基因下调，富集 ECM 重塑、炎症反应、上皮 - 间质转化等纤维化相关通路;同时与 Hoshida 肝癌预后差亚型 S1 高度匹配，提示 TP53 缺失可能推动纤维化向癌变过渡。

图4：TP53KO-eHEPOs 的纤维化表型与早期癌标志物

该图验证纤维化表型与癌变关联：qPCR 显示 TP53KO 类器官中 COL1A1、COL3A1、PDGFRB 等纤维化标志物较野生型高 2-3 倍，Masson 染色观察到胶原沉积显著增加;H&E 染色见异型细胞、假腺管样结构等人类纤维化典型病理特征，免疫组化显示早期肝癌标志物 GPC3、MUC1 表达显著升高。

图5：TP53KO-eHEPOs 的通路异常与干细胞标志物变化

结果揭示通路调控机制：报告基因检测显示，TP53KO 类器官 Wnt 通路活性较野生型降低 40%，TGF-β 通路活性升高 2 倍;流式细胞术显示 EpCAM、CD24(肝祖细胞标志物)降低，CD133(癌干细胞标志物)升高，pf-DM 处理进一步加剧该趋势，证实 TP53 缺失通过通路调控推动纤维化进展。

全文总结

本研究通过 CRISPR/Cas9 构建 TP53 敲除肝类器官，结合促纤维化微环境，首次实现 “基因缺陷 + 微环境” 双调控，成功复现人类肝纤维化的病理特征与分子通路，同时检测到早期肝癌标志物升高。该模型解决了传统模型不贴合人类生理的问题，为肝纤维化早期机制研究与药物筛选提供可靠工具，但仍需整合多基因缺陷、验证药物干预效果以提升转化价值。