USP45 通过去泛素化并稳定抑癌蛋白 MRGPRF 抑制黑色素瘤发生

基本信息

英文标题：USP45 Represses Melanoma Development by Deubiquitinating and Stabilizing Tumor Suppressor MRGPRF

中文标题：USP45 通过去泛素化并稳定抑癌蛋白 MRGPRF 抑制黑色素瘤发生

发表期刊：《Nature Metabolism》

影响因子：14.3

作者单位：

中南大学

湘雅三医院

汕头大学等

作者信息：

Wancong Zhang, Liyun Chen, Jing Zhao, Aiwei Ma, Wenqi Shi, Yiwen Zhang, Zixuan Tang, Jiarui Guo, Zaihua Xu, Jianda Zhou, Shijie Tang

研究背景

研究背景：

1.临床/生物学问题：

黑色素瘤是一种高度恶性的皮肤癌，发病率持续上升。尽管已有靶向治疗和免疫治疗，但由于耐药性和药物反应不佳，仍需发现新的治疗靶点。

2.现有研究的局限性：

MRGPRF是一个新发现的黑色素瘤抑制因子，能抑制PI3K/AKT通路，但其在黑色素瘤中的蛋白质稳定性调控机制尚不明确，尤其是去泛素化酶是否参与其中未被系统研究。

3.研究切入点与创新点：

本研究筛选了40个USP家族成员，首次发现USP45是MRGPRF的稳定因子，通过去除其K63连接的多聚泛素链来抑制黑色素瘤进展。研究揭示了USP45-MRGPRF轴在黑色素瘤中的抑癌机制，提出了USP45可作为潜在治疗靶点。

研究方法

1.动物模型构建：

使用裸鼠皮下注射USP45过表达的A375黑色素瘤细胞，建立异种移植瘤模型。

2.细胞培养与处理：

使用HEK293T、HaCaT、A375、SK-MEL-28、SK-MEL-2、A875等细胞系，进行CHX、MG132等药物处理。

3.分子与细胞生物学实验：

质粒构建与转染

qPCR、Western blot、免疫组化

IP、GST pull-down、双荧光素酶报告实验

细胞周期(7-AAD)、凋亡(Annexin V/PI)、MTT、克隆形成、Transwell迁移/侵袭实验

4.生物信息学分析：

使用TCGA-SKCM和GTEx数据库分析USP45表达与患者预后的关系。

5.体内实验：

肿瘤体积和重量测量

Ki-67 IHC、TUNEL凋亡检测

PI3K/AKT通路蛋白检测

实验结果

图1 | USP45在HEK293T细胞中稳定MRGPRF

图1 A 荧光素酶实验结果显示，各USP单独过表达对HEK293T细胞中MRGPRF-Nanoluc稳定性的影响。正值表示MRGPRF-Nanoluc活性升高，负值表示活性降低。

图1 B Western blot数据显示USP30、USP20或USP45过表达对HEK293T细胞中MRGPRF蛋白水平的影响。

图1 C 图B中Western blot数据的统计柱状图。*p值采用单因素方差分析(ANOVA) followed by Tukey HSD检验。

图2 | USP45在黑色素瘤中表达降低且与患者不良预后相关

图2 A IHC数据显示黑色素瘤及癌旁非癌表皮中USP45蛋白水平。

图2 B 图A中IHC数据的统计分析(n=15)。p值由未配对双侧Student's t检验确定。

图2 C 箱线图显示指定数据集中正常皮肤与黑色素瘤样本之间USP45 mRNA的差异表达。

图2 D 箱线图显示具有指定临床病理特征的黑色素瘤患者中USP45表达水平。

图2 E Kaplan–Meier生存曲线显示黑色素瘤组织中USP45高表达与低表达患者的预后。

图2 F, G qPCR(F)和Western blot(G)结果说明HaCaT角质形成细胞及多种黑色素瘤细胞系中USP45的表达水平。

图2 H 图G中Western blot数据的统计柱状图。p值采用单因素方差分析 followed by Tukey HSD检验。

图3 | USP45在体外抑制黑色素瘤恶性表型并抑制PI3K/AKT通路

图3 A qPCR数据展示HEK293T和A375细胞中USP45过表达效率，以及HEK293T和SK-MEL-2细胞中USP45敲低效率;同时展示指定处理后黑色素瘤细胞中MRGPRF mRNA水平。

图3 B MTT实验显示USP45过表达或沉默对黑色素瘤细胞活力的影响。

图3 C 克隆形成实验结果显示USP45过表达或缺失对A375或SK-MEL-2细胞克隆形成能力的影响。

图3 D 图C中克隆形成实验的统计分析。

图3 E 7-AAD实验结果显示USP45过表达或缺失对黑色素瘤细胞周期的影响。

图3 F 图E中7-AAD实验结果的统计分析。

图3 G Annexin V/PI染色数据显示USP45过表达或缺失对细胞凋亡的影响。

图3 H 图G中数据的统计分析。

图3 I, K Transwell实验结果显示USP45过表达或敲低对A375或SK-MEL-2细胞迁移(I)和侵袭(K)的影响。

图3 J, L 图I和图K数据的定量分析。

图3 M Western blot数据展示对照、USP45过表达或USP45缺失黑色素瘤细胞中USP45、MRGPRF、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT的蛋白水平。

图3 N 图M中Western blot数据的统计柱状图。

图4 | USP45的催化结构域对其抗黑色素瘤功能至关重要

图4 A 野生型USP45和USP45 C199A突变体的结构示意图。

图4 B qPCR数据比较A375细胞中过表达野生型USP45或USP45 C199A对MRGPRF mRNA水平的影响。

图4 C MTT实验结果展示过表达野生型USP45或USP45 C199A的A375细胞的活力。

图4 D 克隆形成实验数据展示过表达野生型USP45或USP45 C199A的A375细胞的克隆形成能力。

图4 E 图D中克隆形成实验的统计分析。

图4 F 7-AAD染色结果显示过表达野生型USP45或USP45 C199A对A375细胞周期的影响。

图5 | USP45通过其催化结构域结合MRGPRF的N端

图5 A Co-IP数据显示A375和SK-MEL-2细胞中USP45与MRGPRF之间的相互作用。

图5 B GST pull-down实验结果说明USP45与MRGPRF直接结合。

图5 C 示意图展示指定USP45亚型的结构。

图5 D, E Co-IP结果说明A375和SK-MEL-2细胞中MRGPRF与指定USP45亚型之间的相互作用。

图5 F 示意图展示MRGPRF亚型的结构。

图5 G, H Co-IP数据展示A375和SK-MEL-2细胞中USP45与指定MRGPRF亚型之间的相互作用。

TCL表示总细胞裂解液。

图6 | USP45通过去除黑色素瘤细胞中MRGPRF的K63连接泛素化来稳定MRGPRF

图6 A Western blot数据显示对照A375和SK-MEL-2细胞及其CHX和MG132处理组中MRGPRF的蛋白水平。

图6 B 图A中Western blot数据的定量分析。p值采用单因素方差分析 followed by Tukey HSD检验。

图6 C Western blot数据展示在CHX存在下，USP45过表达或敲低对A375或SK-MEL-2细胞中MRGPRF降解的影响。

图6 D 图C中Western blot数据的统计分析。

图6 E, F Western blot结果显示USP45过表达显著降低A375细胞中MRGPRF的泛素化水平，而USP45缺失导致SK-MEL-2细胞中MRGPRF泛素化显著增加。

图6 G-J 通过Co-IP实验观察野生型USP45和USP45 C199A对MRGPRF蛋白K63或K48连接泛素化的影响。

图7 | MRGPRF介导USP45在黑色素瘤细胞中的抗癌功能

图7 A MTT实验结果展示MRGPRF缺失对USP45过表达A375细胞活力的影响，以及MRGPRF过表达对USP45缺失SK-MEL-2细胞活力的影响。

图7 B 克隆形成实验数据展示MRGPRF敲低对USP45过表达A375细胞克隆形成能力的影响，以及MRGPRF过表达对USP45缺失SK-MEL-2细胞克隆形成能力的影响。

图7 C 图B数据的定量分析。

图7 D 7-AAD实验结果展示MRGPRF沉默对USP45过表达A375细胞周期的影响，以及MRGPRF过表达对USP45缺失SK-MEL-2细胞周期的影响。

图7 E 图D数据的定量分析。

图7 F Annexin V/PI染色结果展示MRGPRF敲低对USP45过表达A375细胞凋亡的影响，以及MRGPRF过表达对USP45缺失SK-MEL-2细胞凋亡的影响。

图7 G 图F数据的定量分析。

图7 H, J Transwell实验结果展示MRGPRF缺失对USP45过表达A375细胞迁移和侵袭的影响，以及MRGPRF过表达对USP45缺失SK-MEL-2细胞迁移和侵袭的影响。

图7 I, K 图H和图J数据的统计分析。p值采用单因素方差分析 followed by Tukey HSD检验。

图8 | MRGPRF缺失减弱USP45对PI3K/AKT信号通路的抑制作用

图8 A, B Western blot数据展示A375细胞(A)和SK-MEL-2细胞(B)中指定处理下的USP45、MRGPRF、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT蛋白水平。p值采用单因素方差分析 followed by Tukey HSD检验。

图9 | USP45过表达在体内抑制黑色素瘤生长并诱导凋亡

图9 A 对照或USP45过表达A375稳定细胞形成的异种移植瘤的整体视图。

图9 B, C 对照或USP45过表达肿瘤的重量(B)和体积(C)的定量分析(n=6)。

图9 D IHC数据展示对照或USP45过表达肿瘤内的细胞增殖情况(Ki-67染色)。

图9 E 图D数据的统计分析(n=3)。

图9 F qPCR结果显示对照或USP45过表达肿瘤中人源Ki-67 mRNA的表达(n=3)。

图9 G TUNEL实验结果展示对照或USP45过表达肿瘤内的凋亡情况。

图9 H 图G中TUNEL实验数据的统计分析(n=3)。

图9 I Western blot结果展示对照或USP45过表达肿瘤中USP45、MRGPRF、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT的表达。

图9 J 图I数据的定量分析(n=6)。p值由未配对双侧Student's t检验确定。

图10 | USP45-MRGPRF轴抑制黑色素瘤的机制示意图

USP45通过去泛素化稳定MRGPRF，抑制PI3K/AKT通路，从而抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移、侵袭，诱导细胞周期阻滞和凋亡。

研究结论

USP45在黑色素瘤中低表达，低表达与患者不良预后相关。

USP45通过去泛素化稳定MRGPRF，主要去除K63连接的多聚泛素链。

USP45的催化结构域对其与MRGPRF结合及抑癌功能至关重要。

MRGPRF是USP45抑癌功能的关键下游效应因子，介导对PI3K/AKT通路的抑制。

USP45-MRGPRF轴在体内外均能抑制黑色素瘤进展，提示其作为治疗靶点的潜力。

USP45在黑色素瘤中不依赖于MYC和Snail，与在其他癌种中的作用不同，显示其功能具有高度底物依赖性。

文献意义:

首次鉴定USP45为黑色素瘤抑制因子，揭示其在去泛素化调控黑色素瘤中的新角色。

连接USP45与MRGPRF，拓展了对黑色素瘤中PI3K/AKT通路调控机制的理解。

揭示USP45功能具有高度底物依赖性：在宫颈癌、卵巢癌中为癌基因，在黑色素瘤中为抑癌基因。

提示USP45激动剂可能成为黑色素瘤的新型治疗策略。

为研究去泛素化酶与肿瘤抑制因子的调控网络提供了范例。