E2F1 调控 miR-215-5p 通过抑制 BMPR2 表达加重百草枯诱导的肺纤维化

检测细胞株广泛应用于药物发现、抗体开发、基因研究和毒性评估等领域。基于D-Luciferase的报告基因细胞株及其荧光素酶检测方法在药物初筛/复筛、表位竞争、药物生物活性检测等多方面展现了广泛的应用潜力。报告基因法已被药典收录，为国家认可的检测方法。报告基因细胞株多用于监测特定的生物过程或信号通路。

HEK293细胞因子报告基因细胞株是以HEK293为工具细胞，采用慢病毒感染的方式构建，不仅能够稳定表达细胞因子受体蛋白，并且能够表达荧光素酶报告基因，是基于转录因子信号通路构建的荧光素酶报告基因细胞系。当细胞因子结合受体蛋白后，细胞因子与受体蛋白相互作用，激活转录因子信号通路，从而激活荧光素酶的表达。荧光信号的强弱即代表信号通路的激活效果，因此可用于相关药物的体外效果评价，筛选抗体以及筛选信号通路的激活剂或抑制剂。

基本信息

英文标题：E2F1 regulates miR-215-5p to aggravate paraquat-induced pulmonary fibrosis via repressing BMPR2 expression

中文标题：E2F1 调控 miR-215-5p 通过抑制 BMPR2 表达加重百草枯诱导的肺纤维化

发表期刊：《Toxicology Research》

影响因子：2.1

作者单位：

Emergency Department, Hunan Provincial People’s Hospital/The First Affiliated Hospital of Hunan Normal University, No.61, Jiefang west Road, Furong District, Changsha, Hunan Province 410005, P. R. China

作者信息：

第一作者：Jie Huang

通讯作者：Xiaotong Han

研究背景

肺纤维化是百草枯(PQ)中毒引发的不可逆肺损伤，也是导致中毒患者呼吸衰竭死亡的主要原因，miRNA 在百草枯诱导的肺纤维化中发挥关键调控作用;E2F1 作为经典转录因子，其在肺纤维化中的功能与分子机制尚不明确，miR-215-5p 在肾纤维化模型中表达异常升高，BMPR2 作为 TGF-β 家族受体与肺纤维化、TGF-β/Smad3 通路活化密切相关，本研究旨在明确 miR-215-5p 在百草枯诱导肺纤维化中的作用及上下游调控机制。

研究方法

构建百草枯干预的小鼠肺上皮 MLE-12 细胞体外肺纤维化模型与 C57BL/6 小鼠体内肺纤维化模型，采用 MTT 法检测细胞活力，免疫荧光、免疫组化、Western blot 检测纤维化标志物及 TGF-β/Smad3 通路蛋白表达，双荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀(ChIP)、RNA 结合蛋白免疫共沉淀(RIP)验证 E2F1、miR-215-5p、BMPR2 的分子相互作用，HE 染色、Masson 染色观察肺组织病理形态，羟脯氨酸实验检测肺组织胶原含量，qRT-PCR 检测基因表达，通过慢病毒转染实现基因沉默 / 过表达，数据采用 GraphPad Prism 6.0 进行统计学分析。

实验结果

图 1 MiR-215-5p 通过激活 TGF-β/Smad3 通路促进百草枯诱导的肺纤维化

百草枯处理后 MLE-12 细胞中 miR-215-5p 表达显著升高，过表达 miR-215-5p 会进一步降低细胞活力、上调 COL1A1、COL3A1、α-SMA 等纤维化标志物及 TGF-β、p-Smad3 蛋白水平，抑制 miR-215-5p 则可逆转上述效应，直接证实 miR-215-5p 通过激活 TGF-β/Smad3 通路加重百草枯诱导的肺纤维化。

图 2 MiR-215-5p 靶向结合并负调控 BMPR2 表达

生信分析筛选出 BMPR2 为 miR-215-5p 的唯一重叠靶基因，双荧光素酶报告基因与 RIP 实验验证二者直接结合，miR-215-5p 过表达可下调 BMPR2 表达、抑制则上调 BMPR2，且百草枯处理会降低 BMPR2 水平，miR-215-5p 可直接调控该过程，明确二者的靶向负调控关系。

图 3 MiR-215-5p 通过抑制 BMPR2 加重百草枯诱导的肺纤维化

沉默 BMPR2 可完全抵消 miR-215-5p 抑制剂对百草枯处理 MLE-12 细胞的保护作用，恢复细胞活力并重新上调纤维化标志物表达，证明 BMPR2 是 miR-215-5p 介导百草枯致肺纤维化的关键下游靶基因，miR-215-5p 通过抑制 BMPR2 发挥促纤维化作用。

图 4 E2F1 靶向结合 miR-215-5p 启动子并正向调控其表达

百草枯处理后 MLE-12 细胞中 E2F1 表达显著升高，ChIP 与双荧光素酶实验证实 E2F1 可直接结合 miR-215-5p 启动子区域，沉默 E2F1 会同步下调 E2F1 与 miR-215-5p 水平，确定 miR-215-5p 是 E2F1 的转录靶基因，E2F1 对其发挥正向调控作用。

图 5 E2F1 通过 miR-215-5p/BMPR2 轴加重百草枯诱导的肺纤维化

沉默 E2F1 可降低百草枯诱导的 miR-215-5p 升高、恢复 BMPR2 表达，提升细胞活力并下调纤维化标志物与 TGF-β/Smad3 通路蛋白，而过表达 miR-215-5p 可完全逆转 E2F1 沉默的保护效应，证实 E2F1 通过调控 miR-215-5p/BMPR2 轴及 TGF-β/Smad3 通路加剧肺纤维化。

图 6 体内验证 E2F1 通过 miR-215-5p/BMPR2 轴促进百草枯致小鼠肺纤维化

小鼠体内实验显示，百草枯可上调 miR-215-5p、下调 BMPR2 并诱发肺泡结构破坏、胶原沉积，沉默 E2F1 可显著改善上述病理改变，而过表达 miR-215-5p 则抵消 E2F1 沉默的保护作用，从动物水平验证 E2F1/miR-215-5p/BMPR2 轴的核心调控作用。

研究结论

本研究通过体外细胞与体内动物实验证实，百草枯诱导肺纤维化过程中 E2F1 表达上调，其转录激活 miR-215-5p，miR-215-5p 直接靶向抑制 BMPR2 表达并激活 TGF-β/Smad3 通路，最终加重肺纤维化进程，E2F1/miR-215-5p/BMPR2 轴可作为百草枯中毒所致肺纤维化的潜在治疗新靶点。