告别细菌克隆丨MIDAS技术一天完成蛋白变体从构建到筛选全过程

在生物医学研究和药物开发领域，生物发光成像技术因其高信噪比而被广泛应用于细胞测定和动物成像研究。然而，传统的荧光素酶种类有限，限制了同时成像多个分子和细胞事件的能力。为了突破这一限制，科学家们开发了一种新型的ATP非依赖性荧光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海虾Oplophorus gracilirostris，并经过工程改造以增强蛋白质稳定性。NanoLuc作为一种小型(19 kDa)、高亮度的荧光素酶，其亮度是传统萤火虫或海肾荧光素酶的100倍，并且使用furimazine作为底物产生明亮的辉光型发光。NanoLuc的意义在于其为双报告基因生物发光分子成像提供了新的可能。它不仅可以在活体小鼠的表层和深层组织中成像，而且其生物发光随时间的变化可以用来定量肿瘤生长，甚至在少量血清中也能检测到分泌的NL。此外，NanoLuc与萤火虫荧光素酶的结合使用，为在完整细胞和活体小鼠中定量TGF-β信号传导的两个关键步骤提供了一种新型双荧光素酶成像策略，从而在正常生理、疾病和药物开发中扩展了信号转导的成像能力。NanoLuc的作用不仅体现在其高灵敏度和高稳定性上，它还具有更小的尺寸，这使得在标记细胞和蛋白质时对样本的侵入性更小，有助于保持细胞或组织的天然状态。NanoLuc的快速反应、低背景发光和多样灵活等特点，使其在生物学和医学研究中具有广泛的应用前景。因此，NanoLuc作为一种新的报告基因，不仅增强了我们对生物过程的理解和疾病机理的研究，而且在开发潜在治疗方法和疗法方面发挥了重要作用。

基本信息

英文标题：Fast analysis and engineering of protein function by microbe-independent deep assembly and screening

中文标题：通过不依赖微生物的深度组装与筛选快速分析和工程化蛋白质功能

发表期刊：《Molecular Systems Biology》

影响因子：7.7

作者单位：

Department of Bioengineering, Stanford University, Stanford, CA, USA

作者信息：

第一作者：Yan Wu, Pengli Wang

通讯作者：Michael Z Lin

研究背景

蛋白质工程和序列-功能分析是生物技术与生物医学研究的核心任务，然而传统方法依赖细菌克隆，耗时费力且成本高昂。即便采用机器学习和深度突变扫描等先进策略，仍然需要构建和筛选大量蛋白变体，尤其是在哺乳动物细胞中验证功能时，需经过亚克隆、质粒提取、转染等繁琐步骤。此外，易错PCR等随机诱变方法难以高效获得需要多个核苷酸改变的有利突变。为解决上述问题，本研究开发了一套名为MIDAS(Microbe-Independent Deep Assembly and Screening)的技术平台，通过多孔PCR直接组装完整基因转录单元并转染至哺乳动物细胞，无需微生物中间步骤，可在一天内完成从PCR到功能筛选的全过程。研究展示了MIDAS在乙酰胆碱生物发光指示剂优化和NanoLuc荧光素酶催化性能提升中的广泛应用，证明了其在蛋白质工程和序列-适应度分析中的高效性和通用性。

研究方法

MIDAS的核心策略是通过重叠PCR在体外直接合成包含启动子、蛋白编码序列和polyA信号的完整转录单元，然后将线性PCR产物直接转染至哺乳动物细胞，每个孔对应一个确定变体。根据突变类型和模板数量，MIDAS分为四种模式：多模板单焦点(MIDAS-PM)、多模板多焦点(MIDAS-PP)、单模板单焦点(MIDAS-MM)和单模板多焦点(MIDAS-MP)。其中单模板模式通过在引物5'端添加唯一序列避免原始质粒模板的再扩增。研究以ACh- NeuBI(基于OpuBC和NanoBiT的ACh生物发光传感器)为优化模型，通过MIDAS-MP和MIDAS-MM依次进行了linker长度筛选、linker残基优化、SmBiT变体筛选、计算机预测突变评估以及多位点组合饱和诱变。同时，利用MIDAS-MM对NanoLuc活性中心的25个位点进行所有20种氨基酸的饱和诱变，以FFz、CFz9和Fz为底物评估催化活性，并以共表达的萤火虫荧光素酶为内参进行标准化。体外验证包括HEK293A细胞、原代皮层神经元转染，以及小鼠体内水动力转染和生物发光成像。数据采用非线性回归和t检验分析。

实验结果

图 1：MIDAS的总体策略与四种模式

图1A展示了MIDAS的核心理念：通过PCR直接组装完整基因表达盒并转染至多孔板中，次日即可进行功能检测，无需细菌步骤。图1B-E分别定义了MIDAS的四种模式：MIDAS-PM(多模板、单焦点突变)、MIDAS-PP(多模板、多焦点组合突变)、MIDAS-MM(单模板、单焦点突变，通过嵌套引物避免模板再扩增)和MIDAS-MP(单模板、多焦点组合)。该图清晰呈现了MIDAS如何根据蛋白质工程需求灵活选择不同的组装策略，为后续实验奠定了基础。

图 2：利用MIDAS-MP和MIDAS-MM逐步优化ACh-NeuBI

图2A展示了ACh-NeuBI0.1的结构，由OpuBC的ACh结合域与分裂的NanoLuc(SmBiT和LgBiT)融合而成。图2B验证了PCR产物直接转染与质粒转染产生的响应无显著差异，证明线性PCR产物可直接用于功能检测。图2C通过MIDAS-MP筛选linker1和linker2的长度组合(各0-5个甘氨酸)，发现linker1为1个甘氨酸、linker2为0个时响应最优(约50%增强)，命名为ACh-NeuBI0.2;突变ACh结合位点后响应消失，证实特异性。图2D通过MIDAS-MM对linker1的单个残基进行所有20种氨基酸替换，发现脯氨酸(P)最佳，响应提升至约80%，命名为ACh-NeuBI0.3。图2E对SmBiT进行截短和点突变筛选，发现SmBiT(ΔC3)及其与L163E组合均使响应提升至约2.5倍，最终选择亮度更高的SmBiT(ΔC3)命名为ACh-NeuBI0.4。每一步均通过质粒转染复验证实，证明了MIDAS筛选结果的可靠性。

图 3：基于MIDAS的深度诱变和组合突变进一步提高ACh-NeuBI亲和力与响应

图3A展示了AlphaFold3预测的ACh-NeuBI0.5结构(加入了mScarlet-I用于红移)，并标记了16个待诱变位点。图3B的热图显示，通过MIDAS-MM对16个位点分别进行20种氨基酸替换(共320个变体)，并在1 μM、10 μM和1 mM ACh下检测响应，发现G550Q、L560C/E和A610D/E等突变在低浓度ACh下表现优异。图3C的剂量响应曲线证实这些突变使表观Kd从898 μM降至约200-300 μM。图3D进一步对560和610位点进行20×20组合饱和诱变(400个变体)，热图显示QAD、QAE、QCE、QED等组合在1 μM ACh下即有明显响应。图3E确认QAE(G550Q+L560A+A610E)具有最高亮度和亲和力(Kd=188 μM)，命名为ACh-NeuBI1b;QED(G550Q+L560E+A610D)具有最低本底和最高对比度(640%增强)，命名为ACh-NeuBI1c，相较于起始ACh-NeuBI0.1(22%增强)提升了29倍。图3F通过Chai-1预测结构显示G550Q的Gln侧链与Tyr-512和Tyr-615形成氢键，可能稳定ACh结合后的闭合构象。

图 4：ACh-NeuBI变体在体内的验证

图4A展示了小鼠体内水动力转染和ACh刺激实验方案。图4B为代表性生物发光图像，显示随着ACh剂量增加，ACh-NeuBI0.5、1b和1c的发光强度均显著增强。图4C量化显示：在0.1 mg/kg ACh下，NeuBI0.5的响应为3.5倍，NeuBI1b和1c分别达到10.6和10.2倍;在10 mg/kg ACh下，三者分别达到30、103和173倍。表明MIDAS优化的变体在体内具有更优异的灵敏度和动态范围，且在对照实验中ACh不改变游离NanoLuc的亮度，证实信号特异性。

图 5：MIDAS-MM应用于NanoLuc催化活性改进

图5A展示了双顺反子载体设计：FLuc作为内参，P2A后为NanoLuc变体，通过FLuc信号归一化转染效率。图5B标注了NanoLuc底物结合口袋的25个残基。图5C显示了500个MIDAS变体(25位点×20氨基酸)相对于野生型的相对活性热图，发现D108N对所有三种底物(Fz、FFz、CFz9)均有提升，D108S仅对FFz有提升。图5D通过质粒转染验证确认了D108N使FFz底物发光提升约30%，D108S对FFz也优于野生型。此外，D108S需要两个相邻核苷酸同时改变(GAC→AGC)，在随机诱变中极为罕见，突显了MIDAS确定性诱变的优势。

图 6：NanoLuc突变耐受性与底物特异性分析

图6A利用MIDAS-MM产生的全部500个变体的数据，对每个位点计算“耐受性”(即所有20种氨基酸的活性总和)。结果显示最耐受的位点为Tyr-109、Ile-137和Trp-161，其中最不耐受的为Pro-40、Ile-56、Tyr-114和Arg-162，与结构预测的结构功能和催化机制一致。图6B进一步识别出底物偏好性突变：L18M和G160Q偏好Fz;V38E和D108S偏好FFz;V58N和L92Q偏好CFz9。这些特异性决定位点有些与底物结构差异区域相符(如G160Q靠近Fz的苄基)，有些则远离底物差异区，说明特异性调控难以仅靠结构预测，需要经验筛选。该图充分展示了MIDAS不仅能筛选改进突变，还能快速获得序列-功能关系的全景数据。

图 7：扩展数据图(EV1-EV11)补充了关键验证

EV1展示了MIDAS-PP和MIDAS-MP的替代方案(将全部组合放在一条引物中)。EV2筛选了不同NanoLuc环状排列插入位点，选择了T4(SmBiT+LgBiT)作为起点。EV3展示了引入mScarlet-I进行共振能量转移，实现发射光谱红移。EV4-10详细表征了ACh-NeuBI0.5、1b、1c在细胞和体内的选择性、动力学、亲和力和成像性能。EV11关键性地证明了MIDAS-MM中嵌套引物设计可完全避免模板质粒的再扩增，确保突变纯正。

研究结论

本研究建立了一套名为MIDAS的不依赖微生物的深度组装与筛选平台，通过多孔重叠PCR直接合成完整基因表达单元并转染至哺乳动物细胞，可在一天内完成数百个蛋白变体的构建与功能检测，相较于传统克隆方法速度提升约48倍、成本降低约10倍。MIDAS支持单模板/多模板、单焦点/多焦点等多种诱变模式，适用于linker优化、单点饱和突变、组合突变和计算机预测验证等多种工程任务。利用MIDAS，研究者将ACh生物发光传感器ACh-NeuBI的响应从22%逐步提升至640%(29倍)，并获得了体内灵敏检测ACh的变体ACh-NeuBI1b和1c。同时，通过对NanoLuc活性中心25个位点的全面扫描，不仅筛选出对新型底物FFz和CFz9活性提升的突变(如D108N、D108S)，还绘制了每个位点的突变耐受性图谱和底物特异性决定因子。MIDAS为在哺乳动物细胞中进行快速、高质量、低成本的蛋白质工程和序列-适应度分析提供了通用解决方案，尤其适用于需要多孔板检测且无法通过流式筛选的酶和生物传感器体系。