靶向CD36的温敏小檗碱纳米凝胶阻断肿瘤脂质劫持并增强抗PD-L1免疫疗法在三阴性乳腺癌中的应用

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：A CD36-Targeting Thermosensitive Berberine Nanogel Blocks Tumor Lipid Hijacking and Potentiates Anti-PD-L1 Immunotherapy in Triple-Negative Breast Cancer

中文标题：靶向CD36的温敏小檗碱纳米凝胶阻断肿瘤脂质劫持并增强抗PD-L1免疫疗法在三阴性乳腺癌中的应用

发表期刊：《Molecular Pharmaceutics》

影响因子：4.5

作者单位：

1.School of Pharmaceutical Sciences, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, Zhejiang 310053, China

2.Lanxi Hospital of Traditional Chinese Medicine, Jinhua, Zhejiang 321100, China

3.School of Biological and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu’an, Anhui 237012, China

4.Affiliated Hospital of Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000, China

作者信息：

第一作者：Wanyu Jin, Shujun Xu, Hongyan Zhang

通讯作者：Yang Xiong

研究背景

三阴性乳腺癌对PD-L1单抗免疫治疗的反应率较低，主要归因于其高度免疫抑制的肿瘤微环境。肿瘤相关脂肪细胞是TNBC微环境的重要组成，通过上调肿瘤细胞表面的CD36(脂肪酸转位酶)，促进脂肪酸的大量摄取和脂滴积累，进而“饥饿”免疫细胞并抑制其功能。小檗碱是一种来自黄连的生物活性生物碱，已有研究表明其可通过下调CD36改善代谢性疾病中的脂质代谢紊乱。本研究提出假设：BBR可通过抑制CD36介导的脂肪酸摄取和脂滴积累，重塑TME，增强aPD-L1的疗效。为克服BBR水溶性差和体内快速清除的问题，研究团队开发了一种温敏水凝胶纳米粒递送系统。

研究方法

本研究首先通过诱导3T3-L1前脂肪细胞成熟并与4T1细胞共培养，建立CAAs模型并收集条件培养基。采用MTT法评估细胞增殖，Oil Red O染色观察脂滴积累，Western blot和RT-PCR检测CD36表达。通过乳化溶剂蒸发法制备BBR纳米粒，再与泊洛沙姆温敏水凝胶复合形成BBR-NPs-GEL，利用粒径分析、TEM、流变学测试、释放曲线等手段进行表征。在4T1荷瘤小鼠模型中评估BBR-NPs-GEL单独或联合aPD-L1的抗肿瘤效果，通过流式细胞术、免疫荧光、ELISA、脂质组学等分析TME中免疫细胞浸润、细胞因子和脂质代谢变化，并评估体内生物安全性。

实验结果

图 1：BBR抑制CAAs诱导的4T1细胞增殖和脂滴积累

研究人员首先通过共培养系统将成熟的3T3-L1脂肪细胞与4T1乳腺癌细胞间接接触，获得CAAs条件培养基。图1B显示，CAAs-CM以浓度依赖方式(25%、50%、75%、100%)显著促进4T1细胞活力，尤其是75%和100%浓度下较对照组提升了超过50%的增殖率(p < 0.001)。图1C中，单独使用BBR(5–20 μM)对4T1细胞无明显毒性，但在75% CAAs-CM存在下，BBR以浓度依赖方式抑制细胞增殖，20 μM BBR处理几乎完全抵消了CAAs-CM的促增殖效应。图1D-E的Oil Red O染色及定量分析表明，CAAs-CM使4T1细胞内脂滴面积增加约4倍，而BBR(20 μM)可将其降低近70%，说明BBR通过减少脂滴积累阻断CAAs提供的能量来源，从而抑制肿瘤细胞增殖。

图 2：BBR通过抑制CD36表达减少CAAs诱导的脂滴积累

图2A-D通过Western blot和RT-PCR展示了BBR对CD36表达的调节作用：BBR(5、20 μM)处理24或48小时后，4T1细胞中CD36的mRNA和蛋白水平均呈时间及浓度依赖性下降，20 μM处理48小时使CD36蛋白水平降至对照组的约30%。图2E-F进一步显示，即使在75% CAAs-CM刺激下(CAAs会上调CD36)，BBR依然能显著抑制CD36的高表达。为验证功能相关性，图2G-I使用了CD36特异性激动剂Hex(10 μM)。在CAAs-CM存在下，Hex完全逆转了BBR对脂滴积累的抑制作用(图2G-H)，并使细胞增殖恢复到BBR单独处理组中抑制的水平(图2I)。该结果表明BBR的作用核心在于抑制CD36通路，而非直接毒性。

图 3：脂质组学分析显示BBR减少CD36驱动的脂质积累

该研究对PBS组和BBR治疗组(10 mg/kg，瘤内注射)的4T1肿瘤组织进行了非靶向脂质组学分析。图3A显示共鉴定出超过20类脂质、500余种脂质分子。图3B定量比较了各类脂质的总相对含量，BBR组几乎所有脂质种类均减少，其中甘油三酯(TAG)下降最为显著(p < 0.001)。图3C的热图层次聚类分析清晰地将两组样本分开，表明BBR整体重塑了脂质谱。图3D进一步分析了TAG不同脂肪酸链种类，发现BBR特别显著降低了含饱和脂肪酸(16:0、14:0)的TAG。图3E-H通过Western blot、RT-PCR和免疫荧光证实BBR处理显著下调肿瘤组织中CD36的表达(蛋白减少约60%，p < 0.01)，荧光面积减少至对照的约40%。这证明了BBR在体内同样通过CD36减少脂滴积累。

图 4：BBR重塑4T1肿瘤的免疫微环境

流式细胞术分析显示，BBR治疗组(10 mg/kg)相较于PBS组：CD3+ T细胞浸润增加15%，CD8+ T细胞比例从约10%提升至约37%(图4A-C)，CD8/CD4比值增加了近1倍(图4D)。树突状细胞活化比例从0.53%升至1.68%(+8.39%)(图4E)。免疫抑制细胞方面(图4F-H)：MDSCs减少约30%，M2型巨噬细胞从约25%降至约6%(-19.13%)。图4I-J的免疫荧光染色也证实CD8+ T细胞浸润显著增加。ELISA(图4K-M)显示BBR组肿瘤内IL-6、TGF-β和CCL2水平分别下降约60%、50%和45%，说明BBR通过降低促免疫抑制因子，促进了抗肿瘤免疫细胞的募集与活化。

图 5：BBR-NPs-GEL的制备与表征

图5A-B显示，优化后的BBR纳米粒平均粒径为93.95 ± 0.55 nm，PDI为0.1左右，Zeta电位为0.03 ± 0.59 mV，接近中性。TEM图像(图5C)表明颗粒呈球形、分布均匀。图5D显示在4°C储存7天内粒径和PDI基本不变，稳定性良好。图5E的温度扫描流变学结果显示，储能模量G'与损耗模量G''在约28°C交叉，确认为溶胶-凝胶转变温度;体温(37°C)时G'远高于G''，形成稳定凝胶。图5F的倒置法验证了这一结果。图5G的剪切变稀行为(粘度随剪切速率增加下降3个数量级)确保了可注射性。图5H的步应变测试显示凝胶在高剪切破坏后2秒内恢复90%以上G'，快速自愈合。图5I的注射实验直观证实了易挤出成胶。图5J的释放曲线表明BBR-NPs-GEL较游离BBR-NPs具有显著缓释效果：前4小时仅释放38%，48小时累计释放85%，而游离NPs 4小时已释放76%。

图 6：BBR-NPs-GEL增强aPD-L1的抗肿瘤疗效

图6A展示了第0、3、6、9、12天给药的治疗方案。图6B-D显示：PBS组肿瘤持续生长至约1200 mm³;aPD-L1单药(0.1 mg/kg，腹腔注射)疗效有限，最终体积约900 mm³;BBR单药(10 mg/kg，瘤内注射)抑制肿瘤生长至约600 mm³;BBR-NPs-GEL单药效果更佳，约450 mm³;而BBR-NPs-GEL + aPD-L1联合治疗组平均肿瘤体积仅约250 mm³，且肿瘤重量最低(图6C)。图6D的肿瘤离体照片直观显示了联合组的肿瘤最小。图6E-F的活体生物发光成像及定量分析表明联合治疗组肿瘤细胞存活率持续下降，第15天BLI信号仅为PBS组的约15%。图6G的H&E染色显示联合组肿瘤组织出现大面积坏死、细胞核固缩和大量免疫细胞浸润，而其他组肿瘤细胞结构相对完整。

图 7：BBR-NPs-GEL重塑TME并协同aPD-L1治疗

流式细胞术分析TME中免疫细胞变化：图7A-C显示，相较于PBS组，aPD-L1单药未能增加CD8+ T细胞浸润;BBR单药使CD8+ T细胞比例升至约35%;BBR-NPs-GEL进一步升至约48%;联合治疗组最高，达约55%(p < 0.001 vs 其他组)。CD4+ T细胞也呈类似趋势。图7D-E显示活化DC的比例：对照组约0.8%，aPD-L1组约1.0%，BBR组约2.0%，BBR-NPs-GEL组约3.2%，联合组约4.5%。图7F-G显示巨噬细胞极化的转变：M1型巨噬细胞(抗肿瘤)在联合组中比例最高(约18% vs PBS组约8%)，M2型(免疫抑制)在联合组中比例最低(约5% vs PBS组约25%)，M1/M2比值提升超过10倍。这表明BBR-NPs-GEL联合aPD-L1能够最有效地将“冷”肿瘤微环境转变为“热”状态，逆转代谢诱导的免疫抑制。

研究结论

本研究首次提出并验证了小檗碱通过抑制CD36介导的脂肪酸摄取和脂滴积累，重塑三阴性乳腺癌免疫微环境，从而增强抗PD-L1免疫治疗疗效的机制。为解决BBR水溶性差和体内快速清除问题，研究团队成功开发了一种温敏水凝胶纳米粒递送系统BBR-NPs-GEL，具备良好的温敏性、缓释性和注射性。在4T1荷瘤小鼠模型中，BBR-NPs-GEL显著抑制肿瘤生长，增加CD8+ T细胞、DC和M1型巨噬细胞浸润，减少M2型巨噬细胞和 immunosuppressive cytokines，并与aPD-L1联合表现出协同抗肿瘤效果。该研究为“代谢-免疫”交叉调控策略提供了创新平台，具有较高的临床转化潜力。