HBV通过JNK介导的自噬促进肝癌和肝纤维化中的上皮-间充质转化

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：HBV promotes epithelial-mesenchymal transition in HCC and liver fibrosis through JNK-mediated autophagy

中文标题：HBV通过JNK介导的自噬促进肝癌和肝纤维化中的上皮-间充质转化

发表期刊：《Hepatology Communications》

影响因子：4.6

作者单位：

1.Center of Hepato-Pancreato-Biliary Surgery, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Guangdong Province, China

2.Liver Center and Gastrointestinal Division, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA

3.Department of Pathophysiology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou, Guangdong Province, China

4.Department of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei, Anhui Province, China

5.Department of Infectious Diseases, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang, Liaoning Province, China

作者信息：

第一作者：Dong Chen, Jian Hong

通讯作者：Raymond T. Chung, Wenyu Lin

研究背景

乙型肝炎病毒是导致肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌的主要病因之一，但其感染肝细胞后如何精确促进肝纤维化和肝癌发生的机制尚不明确。自噬在肝纤维化和HCC进展中发挥重要作用，而HBV感染也被证实可诱导自噬，但自噬与HBV相关肝病的关系仍存在争议。上皮-间充质转化是癌细胞获得转移潜能的关键过程，也参与肝纤维化，但HBV感染背景下自噬与EMT之间的相互作用知之甚少。TGF-β1是肝纤维化和EMT的重要调节因子，本研究假设HBV通过诱导自噬促进EMT和肝纤维化，且TGF-β1和JNK信号通路可能参与其中。作者利用HBV复制细胞系(HepAD38)、NTCP过表达的HBV感染模型(Huh7.5.1-NTCP)以及原代人肝细胞，系统探讨了HBV诱导的自噬在EMT和肝纤维化中的作用及其分子机制。

研究方法

本研究采用HepG2/HepAD38(四环素调控HBV复制)、Huh7.5.1-NTCP(过表达NTCP受体)及原代人肝细胞模型。通过qPCR检测HBV DNA及基因表达，Western blot检测自噬(LC3-I/II转换、SQSTM1、ATG5、ATG7、BECN1)、EMT(E-cadherin、vimentin)和纤维化(α-SMA、TIMP1、col1A1)标志物。免疫荧光检测LC3 puncta和vimentin表达。使用siRNA敲低ATG5、ATG7、TGF-β1或JNK，过表达HBV亚基因组(X、C、S、P)及全长HBV 1.2。Transwell侵袭实验和划痕愈合实验评估细胞迁移侵袭能力。TGF-β1处理观察其对自噬/EMT/纤维化的影响。使用tenofovir抑制HBV复制验证相关性。所有实验重复至少3次，数据以mean±SD表示，采用t检验或Mann-Whitney U检验。

实验结果

图 1：HBV复制促进自噬、肝纤维化和EMT

图1A显示HepAD38细胞撤除四环素后HBV DNA显著增加。图1B-C的qPCR结果显示，HBV复制细胞中自噬相关基因ATG5、ATG7、BECN1和LC3 mRNA升高，而自噬底物SQSTM1 mRNA下降(提示自噬流增强)。图1D的Western blot证实HepAD38细胞中LC3-I向LC3-II转换增加，ATG5、ATG7、BECN1蛋白升高，SQSTM1蛋白降低。图1E显示EMT标志物vimentin mRNA升高、E-cadherin mRNA下降。图1F显示纤维化标志物α-SMA、TIMP1、col1A1 mRNA升高。图1G的Western blot进一步确认E-cadherin蛋白下降，TIMP1和α-SMA蛋白升高，同时HBc蛋白表达阳性。图1H的Transwell实验表明HBV复制增强HepAD38细胞侵袭能力。这些结果首次系统证明HBV复制促进了自噬、EMT、肝纤维化和HCC侵袭。

图 2：HBV感染促进自噬、肝纤维化和EMT

图2A显示在Huh7.5.1-NTCP细胞中接种HBV后HBV DNA显著升高。图2B-C的qPCR显示HBV感染上调ATG5、ATG7、BECN1和LC3 mRNA，下调SQSTM1。图2D的Western blot证实LC3-II转换增加，ATG5、ATG7、BECN1蛋白升高。图2E显示vimentin mRNA升高、E-cadherin mRNA下降。图2F显示α-SMA、TIMP1、col1A1 mRNA升高。图2G的Western blot确认HBc表达，以及E-cadherin下降、vimentin和α-SMA、TIMP1升高。图2H的Transwell实验表明HBV感染增强细胞侵袭。该结果与HepAD38模型一致，证明HBV感染同样诱导自噬、EMT和纤维化。

图 3：HBV诱导的EMT和肝纤维化依赖于自噬

图3A显示，在HepAD38细胞中转染siATG5或siATG7后，ATG5、ATG7及BECN1 mRNA均显著下降。图3B的免疫荧光显示，敲低ATG5或ATG7后LC3阳性puncta数量明显减少。图3C-D的qPCR显示，自噬抑制后纤维化标志物α-SMA、vimentin mRNA下降，EMT标志物E-cadherin mRNA回升、vimentin下降。图3E的Western blot验证了ATG5/ATG7蛋白敲低，并显示LC3-II转换受阻。图3F显示敲低ATG5/ATG7后E-cadherin蛋白回升，α-SMA和TIMP1蛋白下降。图3G(原文标注为H，可能是笔误)的Transwell实验显示，自噬抑制后HepAD38细胞侵袭能力显著降低。这些结果表明HBV诱导的EMT、纤维化和细胞侵袭依赖于自噬。

图 4：HBV X蛋白和核心蛋白(C)负责诱导自噬/EMT/纤维化

图4A的qPCR显示，在Huh7.5.1细胞中过表达HBV-X、HBV-C或HBV全长(1.2)后，LC3 mRNA升高、SQSTM1 mRNA下降;而HBV-S和HBV-P无显著作用。图4B的Western blot显示仅HBV-X、HBV-C和HBV全长促进LC3-II转换。图4C显示HBV-X和HBV-C上调ATG5、ATG7和BECN1 mRNA。图4D-E显示HBV-X和HBV-C促进vimentin、α-SMA、TIMP1、col1A1 mRNA上调及E-cadherin下调。图4F的免疫荧光显示HBV-X和HBV-C转染后GFP-LC3 puncta增多。图4G的划痕愈合实验表明HBV-X和HBV-C增强细胞迁移。因此，HBV的X和C亚基是驱动自噬、EMT和纤维化的关键病毒成分。

图 5：TGF-β1促进HBV诱导的自噬/纤维化/EMT

图5A显示TGF-β1处理Huh7.5.1细胞后GFP-LC3 puncta和vimentin荧光增加。图5B的Western blot证实TGF-β1剂量依赖性促进LC3-II转换和vimentin表达。图5C显示TGF-β1进一步增强了HepAD38细胞的侵袭能力(相对于未处理组)。图5D显示在HepG2/HepAD38细胞中，TGF-β1处理进一步增强LC3-II转换、α-SMA和TIMP1蛋白表达。图5E的免疫荧光显示，在HBV-X过表达或HBV感染的细胞中，TGF-β1处理进一步增加vimentin荧光强度。表明TGF-β1作为协同因子增强HBV诱导的自噬、EMT和纤维化。

图 6：JNK与TGF-β1相互作用调控HBV诱导的自噬

图6A-B显示，在HepAD38细胞中敲低TGF-β1后，EMT标志物(vimentin↑、E-cadherin↓)和纤维化标志物(α-SMA、TIMP1、col1A1)的变化被部分逆转。图6C的Western blot证实敲低TGF-β1后E-cadherin回升，TIMP1和α-SMA下降。图6D-E显示，敲低TGF-β1对自噬标志物LC3、SQSTM1、ATG5、ATG7、BECN1 mRNA无显著影响。图6F的Western blot同样显示LC3-II转换、ATG5/ATG7蛋白不受TGF-β1敲低影响。图6G显示敲低TGF-β1后，SMAD4、JNK1和JNK2 mRNA均下降。图6H显示敲低ATG5或ATG7后JNK1 mRNA下降，但TGF-β1 mRNA不变。提示JNK1可能比TGF-β1更直接参与自噬调控。

图 7：HBV通过JNK激活促进自噬/EMT/纤维化

图7A显示在HepAD38细胞中敲低JNK后，JNK1 mRNA显著下降，JNK2和SMAD4仅轻微下降。图7B的qPCR显示，在HBV感染的NTCP-Huh7.5.1细胞中敲低JNK后，LC3、TIMP1和JNK1表达均下降。图7C的免疫荧光显示，敲低JNK后HBV诱导的LC3和vimentin荧光均减弱。图7D-E显示HBV-X/C过表达或HBV感染上调TGF-β1 mRNA。图7F显示HepAD38细胞中JNK1 mRNA升高但TGF-β1未升高，再次强调JNK的主导作用。图7G显示在HBV-X或HBV-C转染细胞中，TGF-β1处理或自噬增强(通过ATG5/ATG7过表达)均增加p-JNK水平及vimentin、α-SMA表达。图7H显示在HBV感染背景下，ATG5/ATG7过表达进一步增强p-JNK、vimentin和α-SMA。证实HBV通过磷酸化JNK激活自噬进而促进EMT/纤维化。

图 8：在原代人肝细胞中验证JNK的关键作用

图8A确认PHH可被HBV感染。图8B-C显示，在PHH中敲低JNK后，HBV诱导的LC3、BECN1、TIMP1、vimentin mRNA升高被抑制，即使加入自噬增强剂雷帕霉素或TGF-β1也无法恢复。图8D-E显示敲低ATG5或ATG7同样抑制HBV诱导的自噬/EMT/纤维化相关基因表达并降低JNK1 mRNA。图8F的Western blot显示，HBV感染PHH后LC3-II转换增加，TIMP1、vimentin和p-JNK蛋白升高;而敲低JNK后这些效应消失。图8G提出最终模型：HBV通过激活JNK诱导自噬，进而促进EMT和肝纤维化，导致HCC进展。

研究结论

本研究通过HepAD38、Huh7.5.1-NTCP和原代人肝细胞三种模型，首次系统阐明了HBV通过JNK介导的自噬促进上皮-间充质转化和肝纤维化的分子机制。HBV复制或感染显著增强自噬流，并上调EMT标志物vimentin、下调E-cadherin，同时促进纤维化标志物α-SMA、TIMP1和col1A1表达，增强细胞侵袭能力。自噬关键基因ATG5/ATG7的敲低可逆转上述效应，证明HBV诱导的EMT和纤维化依赖于自噬。病毒蛋白X和核心蛋白(C)是主要效应因子。TGF-β1部分参与此过程，但JNK1才是自噬上游的核心调控分子：HBV通过增强JNK磷酸化激活自噬，而JNK敲低则阻断HBV诱导的自噬、EMT和纤维化。该研究确立了“HBV-JNK-自噬-EMT/纤维化”信号轴，提示JNK可能是治疗HBV相关肝纤维化和肝癌的潜在靶点。