延长干扰素信号：高通量筛选发现新型疫苗佐剂候选分子

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Identification of Compounds That Prolong Type I Interferon Signaling as Potential Vaccine Adjuvants

中文标题：鉴定延长I型干扰素信号的小分子作为潜在疫苗佐剂

发表期刊：《SLAS Discovery》

影响因子：2.7

作者单位：

1.University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA

2.Thermo Fisher Scientific(Madison, WI, USA)

作者信息：

第一作者：Nikunj M. Shukla, Kei-Ichiro Arimoto

通讯作者：Maripat Corr

研究背景

疫苗的有效性高度依赖于佐剂来增强免疫应答，而I型干扰素已被证明是一种强效的天然佐剂。然而，内源性IFN信号在体内会迅速衰减，限制了其持续增强抗原提呈细胞功能的能力。为克服这一局限，研究者提出假设：通过小分子化合物延长APC中IFN诱导的ISRE激活信号，可作为共佐剂提升疫苗免疫效果。既往高通量筛选多聚焦于直接诱导IFN产生的分子，而本研究旨在发现能够维持已启动的IFN信号持续激活的化合物。为此，团队构建了携带ISRE-β-内酰胺酶报告基因的人单核细胞THP-1细胞系，建立了基于FRET的高通量筛选平台，筛选能够延长IFN-α诱导的ISRE激活信号的化合物，并通过体内小鼠免疫模型验证其作为共佐剂的潜力。

研究方法

本研究首先构建了稳定表达ISRE-bla报告基因的THP-1细胞系，通过过表达或敲低USP18验证其对IFN信号调控的响应能力。对细胞密度、血清浓度、底物孵育时间、IFN-α刺激时长等参数进行优化，确定最佳筛选条件：40,000细胞/孔、5% FBS、50 nM IFN-α处理16小时(同时设置6小时完全激活对照)，加入FRET底物后3小时读取荧光比值。对172,145个化合物进行主筛选，采用Murcko骨架聚类和功能类指纹聚类结合Top X策略筛选阳性化合物，再经复筛和结构聚类获得265个确认阳性化合物。对代表性化合物进行MTT毒性测试、Quantigene及qPCR检测IFN诱导基因表达、Western blot检测ISG15和p-STAT1水平。最后在C57BL/6小鼠模型中，以LPS为佐剂、OVA为抗原，评估化合物共免疫后抗原特异性IgG1和IgG2c抗体滴度。

实验结果

图 1：高通量筛选整体工作流程

图1展示了从细胞系构建到最终体内验证的全流程策略。首先通过转导ISRE-bla构建THP-1报告细胞系，优化条件后进行了14,597个化合物的预实验，随后进行172,145个化合物的主筛选。通过基于结构富集的统计方法筛选出2026个化合物进行复筛，再经结构聚类得到265个确认阳性化合物。对其中代表性化合物进行毒性、基因表达和蛋白表达分析，最后在小鼠模型中验证其共佐剂活性。整个流程系统性地实现了从细胞水平到动物水平的逐级筛选。

图 2：THP-1 ISRE-bla细胞系的可行性验证

图2A-B通过调控USP18表达验证了细胞系对IFN信号的响应能力：过表达USP18降低STAT1磷酸化水平，而敲低USP18则延长STAT1磷酸化，说明该细胞系能够感知IFN信号并可用于筛选信号调节剂。图2C-F系统评估了不同细胞密度、血清浓度、底物孵育时间和总刺激时间对ISRE激活信号的影响。结果显示，信号随细胞数和底物孵育时间增加而增强，血清浓度影响不大，而刺激时间在6小时达到峰值后逐渐衰减，为后续优化提供了基础。

图 3：高通量筛选条件的优化

图3A在宽范围条件下扫描，发现12小时时信号最佳，30小时完全衰减;40,000细胞/孔和5% FBS表现更好。图3B精细调整后发现，在50 nM IFN-α刺激下，16小时能最大化“IFN 6h”完全激活对照与“IFN 16h”衰减信号之间的差异，因此选定16小时作为筛选时间点。图3C总结了最终优化方案：细胞解冻后培养24小时，铺板后同时加IFN-α和待测化合物，10小时后向对照孔补加IFN-α(6小时激活)，16小时后加底物，再孵育3小时读板。该方案确保了检测窗口和稳定性。

图 4：化合物筛选结果及初步活性分析

图4A显示预筛中“IFN 6h”与“IFN 16h”对照存在明显分离，表明检测窗足够大。图4B复筛中同样观察到良好分离，成功筛选出265个确认阳性化合物。图4C左图显示大部分化合物在5 μM浓度下对THP-1细胞相对活力>70%，但部分如belinostat和某些喹唑啉类毒性较高。图4C右图显示在小鼠BMDC中，化合物3、5、24(KX2-391)显著增强了IFN-α诱导的Isg56、Isg15、Ifi2712a、Irf7和Ifi16五种基因表达，表明其能有效延长IFN信号。

图 5：代表性化合物的剂量反应和生物学验证

图5A显示化合物3、5、24在无IFN-α时不激活ISRE，证实其并非直接诱导IFN产生，而是延长信号。在20–500 U/mL IFN-α存在下，三者均呈浓度依赖性增强ISRE活性。图5B显示化合物3和24在50 μM内无明显毒性，而化合物5在IFN-α存在下CC50约3 μM。图5C-D在THP-1细胞中确认，化合物3、5、24(1 μM)与IFN-α共处理8小时使ISG15和ISG56 mRNA升高约2倍，24小时ISG15蛋白水平也明显升高，且无IFN-α时无效。图5E显示上述化合物在IFN-α刺激30分钟后p-STAT1水平升高，但6小时后残余效应有限，提示它们可能延缓信号衰减而非无限持续激活。

图 6：候选化合物在小鼠中的共佐剂活性

图6展示了用LPS+OVA作为基础免疫，联合各化合物(100 nmol/只)在第0和7天免疫小鼠，第17天检测抗原特异性抗体。结果显示，化合物1-5显著增强了IgG2c抗体滴度(约1.5 log倍数，p<0.01或p<0.05)，而化合物1-4、6、9显著增强了IgG1滴度。这表明经HTS筛选出的多个结构骨架化合物能够在体内有效提升疫苗的体液免疫应答，验证了延长IFN信号作为共佐剂策略的有效性。

研究结论

本研究成功构建了一个基于FRET报告基因的THP-1 ISRE-bla细胞系，并优化建立了用于高通量筛选延长I型干扰素信号分子的稳健体系。通过对172,145个化合物的筛选，结合结构富集分析和多轮验证，最终获得多个具有不同化学骨架的阳性化合物。其中，化合物3(未明确结构)、5和24(Src激酶抑制剂KX2-391)等能显著延长IFN-α诱导的ISRE激活、增强干扰素刺激基因的表达，并提高STAT1磷酸化水平。在小鼠免疫模型中，这些化合物作为共佐剂与LPS联用，显著提高了OVA特异性IgG2c和IgG1抗体滴度。该研究不仅提供了一种有效的细胞水平筛选策略，还揭示了多种新型疫苗佐剂候选分子，为开发更高效的疫苗提供了重要工具和思路。