m6A修饰调控的鞘脂代谢调节雄性小鼠出生后肝脏发育

基本信息

英文标题：m6 A modification-tuned sphingolipid metabolism regulates postnatal liver development in male mice

中文标题：m6A修饰调控的鞘脂代谢调节雄性小鼠出生后肝脏发育

发表期刊：《Nature Metabolism》

影响因子：20.8

作者单位：

山东大学

武汉大学

德国癌症研究中心等

作者信息：

Shiguan Wang, Shanz Chen, Jianfeng Sun, Pan Han, Bowen Xu, Xinying Li, Youquan Zhong, Zaichao Xu, Peng Zhang, Ping Mi, Cuijuan Zhang, Lixiang Li, Haiyan Zhang, Yuchen Xia, Shiyang Li, Mathias Heikenwalder, Detian Yuan

研究背景

研究背景：

1.临床/生物学问题： 新生儿出生后，各器官需经历显著的转录、表观遗传和生理变化以确保其功能成熟。肝脏从胚胎期的造血器官转变为成年的主要代谢器官，其出生后的发育和功能成熟机制尚不完全清楚。特别是，转录后修饰(如表观转录组)在这一过程中的作用仍有待阐明。

2.现有研究的局限性： 尽管已知多种转录和表观遗传机制调控肝脏发育，但对于RNA修饰(如m6A)在出生后肝脏成熟过程中的具体角色，研究尚不深入且存在争议。例如，关于RNA甲基转移酶METTL3在肝脏特异性敲除后是否导致发育异常，不同研究报道了相矛盾的结果(有的观察到了肝损伤，有的则没有)，背后的原因未知。

3.研究切入点与创新点： 本研究旨在探索RNA m6A修饰在雄性小鼠出生后肝脏发育和功能成熟中的作用。研究发现METTL3的表达在出生后逐渐下降。通过构建肝脏特异性Mettl3敲除小鼠，揭示了Mettl3介导的m6A修饰通过调控鞘磷脂磷酸二酯酶3(Smpd3)的mRNA稳定性，从而精细调节鞘脂代谢稳态。敲除Mettl3会导致Smpd3异常上调，引起有毒神经酰胺(ceramide)的积累，进而诱导线粒体损伤和内质网应激，最终导致肝细胞肥大、肝损伤和生长迟缓。本研究首次将表观转录组调控与鞘脂代谢稳态及出生后肝脏发育联系起来。

研究方法

1.动物模型构建：

通过将Mettl3-floxed小鼠与Alb-Cre转基因小鼠杂交，构建肝脏特异性Mettl3敲除小鼠。

使用AAV8-TBG-Cre在1周龄或8周龄Mettl3-floxed小鼠中诱导肝细胞特异性Mettl3敲除，以研究不同发育阶段敲除的影响。

所有实验均使用雄性C57BL/6J背景小鼠。

2.转录组与m6A修饰图谱分析：

对野生型和Mettl3敲除小鼠肝脏进行RNA测序，分析差异表达基因和通路富集。

通过m6A-RIP-seq绘制肝脏mRNA的m6A修饰图谱，鉴定METTL3的靶基因。

结合RNA-seq和m6A-seq数据，筛选受m6A修饰调控的基因。

3.细胞培养与处理：

分离野生型和Mettl3敲除小鼠的原代肝细胞进行体外实验。

使用小鼠肝细胞系AML12进行siRNA转染，敲低Smpd3和Ythdf2。

使用人HEK293T细胞和H1胚胎干细胞进行CRISPR-Cas9介导的METTL3敲除。

4.分子与细胞生物学实验：

基因与蛋白表达检测： 采用qRT-PCR、免疫印迹和免疫组化检测基因和蛋白表达水平。

RNA稳定性分析： 使用放线菌素D处理原代肝细胞，检测Smpd3等基因mRNA的降解速率。

m6A-RIP-qPCR： 验证特定转录本(如Smpd3)上的m6A修饰水平。

细胞凋亡检测： 采用TUNEL染色和Cleaved Caspase-3免疫组化。

细胞增殖检测： 采用Ki67免疫组化。

线粒体膜电位检测： 使用JC-1探针标记原代肝细胞，通过荧光显微镜观察红/绿荧光强度比。

细胞膜流动性检测： 使用TMA-DPH探针，通过荧光各向异性法测量。

透射电子显微镜： 观察肝细胞中线粒体和内质网的超微结构。

5.脂质组学分析：

采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)定量检测小鼠肝脏中不同种类神经酰胺和鞘磷脂的水平。

6.回补/干预实验：

药理学抑制： 使用Smpd3抑制剂GW4869、Sptlc2抑制剂myristicin和Smpd1抑制剂imipramine处理Mettl3敲除小鼠。

体内siRNA敲低： 通过尾静脉注射脂质体包被的siRNA，在体内敲低Mettl3敲除小鼠肝脏中的Smpd3。

基因过表达： 通过尾静脉注射AAV-Sgms1，在Mettl3敲除小鼠肝脏中过表达Sgms1(催化鞘磷脂合成，与Smpd3作用相反)。

7.血清生化分析：

使用全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶水平，评估肝功能损伤。

8.统计学分析：

使用GraphPad Prism和R软件。两组比较采用双尾Student's t检验，多组比较采用双因素方差分析 followed by Tukey's post hoc检验。m6A峰值分析采用单尾二项检验。生存曲线分析采用log-rank检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

实验结果

图1 | METTL3在胚胎期和新生期肝脏中高表达，在出生后肝脏发育过程中表达量下降

a. 主成分分析图，显示12个时间点肝脏样本的转录组随时间变化的分布。

b. 功能注释网络，通过时间序列分析将差异表达基因分为三个主要表达簇，并用饼图着色表示。

c. 显示不同基因簇富集的GO和KEGG通路的熱图(根据P值着色)。

d. 热图显示三个基因簇中代表性基因(包括Mettl3, Mettl14)的mRNA表达动态。

e. qRT-PCR验证不同日龄小鼠肝脏中Mettl3, Mettl14, Fto等基因的表达变化(n=6)。

f. 不同日龄小鼠肝脏中METTL3的免疫组化染色，显示肝细胞是主要表达细胞。

g. RNA dot-blot分析显示肝脏总RNA m6A水平在出生后逐渐下降(n=6)。

图2 | 肝脏特异性Mettl3缺陷导致肝细胞肥大、肝损伤和生长迟缓

a-b. 通过qRT-PCR (a) 和免疫印迹 (b) 验证Mettl3在敲除小鼠肝脏中被有效敲除。

c. RNA dot-blot显示Mettl3敲除小鼠肝脏总RNA m6A水平显著降低。

d. 免疫组化确认肝细胞特异性Mettl3敲除。

e-f. Mettl3敲除小鼠(Mettl3ΔHep)表现出显著的出生后生长迟缓 (e) 和体重降低 (f)。

g. Mettl3敲除小鼠血清中ALT和AST水平显著升高，提示肝损伤。

h. Mettl3敲除小鼠肝脏外观苍白、表面粗糙。

i-j. H&E染色显示Mettl3敲除小鼠肝细胞 (i) 和细胞核 (j) 体积显著增大。

k. TUNEL和Cleaved Caspase-3染色显示Mettl3敲除小鼠肝细胞凋亡增加。

l-m. 免疫印迹 (l) 和免疫组化 (m) 证实凋亡相关蛋白(cl-Casp3, BAX, Cyto-c)表达上调。

n. Ki67、CK19和EpCAM染色显示Mettl3敲除小鼠肝脏中代偿性增殖和导管反应增强。

图3 | 出生后诱导肝细胞特异性Mettl3敲除不引起肝损伤

a. AAV8-Cre处理1周龄Mettl3-floxed小鼠的实验时间线。

b. 与从出生后即敲除的Mettl3ΔHep小鼠不同，AAV8-Cre小鼠在42日龄时血清ALT/AST未见显著升高。

c. AAV8-Cre小鼠肝脏外观正常。

d-e. qRT-PCR (d) 和免疫组化 (e) 显示，在21日龄前，AAV8-Cre小鼠肝脏中Mettl3敲除不完全。

f. 28日龄时，AAV8-Cre小鼠肝脏m6A水平仍显著高于从出生后即敲除的Mettl3ΔHep小鼠。

图4 | Mettl3缺陷导致鞘脂代谢重编程

a. Mettl3ΔHep vs WT肝脏差异表达基因的火山图。

b-c. GO分析显示上调基因富集在细胞周期 (b)，下调基因富集在代谢过程 (c)。

d-e. KEGG通路富集分析显示“Sphingolipid metabolism”是变化最显著的代谢通路 (d, e)。

f-g. qRT-PCR (f) 和通路示意图 (g) 显示鞘脂代谢相关基因(如 Smpd3, Smpd1, Sptlc2)在Mettl3ΔHep肝脏中显著上调。

h. 免疫印迹验证Smpd3, Smpd1, Sptlc2蛋白水平上调。

i-k. 免疫组化染色确认Smpd3 (i), Smpd1 (j), Sptlc2 (k) 在Mettl3ΔHep肝脏中表达增强。

图5 | METTL3通过m6A介导的RNA降解调控Smpd3表达

a. m6A-seq显示Mettl3敲除后，GGAC保守基序上的m6A富集信号减少。

b-c. Mettl3敲除导致mRNA 3'UTR区域的m6A修饰水平降低 (b) 和分布改变 (c)。

d. 累积分布图显示，在Mettl3敲除肝脏中，带有m6A标记的转录本丰度显著高于未标记的转录本。

e. 结合RNA-seq和m6A-seq，鉴定出714个表达上调和m6A低甲基化的重叠基因。

f. 通路分析显示这些重叠基因富集在鞘脂代谢通路。

g. IGV截图显示Smpd3基因上m6A peaks的分布及在Mettl3敲除后的减少。

h. RNA稳定性实验显示，在Mettl3缺陷的原代肝细胞中，Smpd3 mRNA降解速率显著减慢。

i. m6A-RIP-qPCR证实Mettl3敲除肝脏中Smpd3 mRNA上的m6A水平显著降低。

j. 敲低m6A阅读器Ythdf2同样导致Smpd3 mRNA降解减慢。

k-l. 出生后发育过程中，Smpd3 mRNA水平与m6A水平呈负相关 (k)，而Mettl3ΔHep小鼠中Smpd3过早异常高表达 (l)。

图6 | Mettl3缺陷导致神经酰胺积累、线粒体损伤和内质网应激

a. 脂质组学分析显示Mettl3ΔHep肝脏中多种神经酰胺(Cer)物种水平显著升高。

b. 透射电镜显示Mettl3缺陷肝细胞中线粒体出现电子密度降低、嵴断裂等退化特征。

c. 透射电镜显示Mettl3缺陷肝细胞中内质网肿胀和核周间隙扩张。

d-e. JC-1染色显示Mettl3缺陷原代肝细胞中线粒体膜电位降低。

f-g. qRT-PCR (f) 和MDA免疫组化 (g) 显示Mettl3ΔHep肝脏中氧化应激水平升高。

h-i. 免疫印迹 (h) 和qRT-PCR (i) 显示PERK分支的内质网应激通路(p-eIF2α, ATF3, CHOP)被特异性激活。

j-k. 免疫组化证实Mettl3ΔHep肝脏中BIP (j) 和p-eIF2α (k) 表达增强。

图7 | 药理学抑制Smpd3可改善Mettl3缺陷诱导的肝损伤

a. GW4869(Smpd3抑制剂)处理Mettl3ΔHep小鼠的实验方案。

b. GW4869处理显著降低了Mettl3ΔHep小鼠升高的血清ALT/AST水平。

c. GW4869处理部分恢复了Mettl3ΔHep小鼠的体重。

d. GW4869处理改善了Mettl3ΔHep小鼠的肝脏大体外观和H&E组织学结构。

e. 脂质组学显示GW4869处理逆转了神经酰胺的积累。

f. 电镜显示GW4869处理改善了线粒体和内质网的超微结构损伤。

g-j. 免疫印迹 (i) 和免疫组化/荧光 (h, j) 显示GW4869处理减轻了细胞凋亡、内质网应激和代偿性增殖。

图8 | 体内敲低Smpd3或过表达Sgms1可挽救Mettl3缺陷表型

a. 体内siRNA敲低Smpd3的实验方案。

b-d. qRT-PCR (b)、免疫印迹 (c) 和免疫组化 (d) 验证体内Smpd3敲低效率。

e. 脂质组学显示敲低Smpd3部分逆转了神经酰胺的积累。

f-i. 敲低Smpd3促进了体重恢复 (f)，改善了肝脏大体外观 (g) 和组织学结构 (h)，并降低了血清ALT/AST (i)。

j-k. 免疫组化 (j) 和免疫印迹 (k) 显示敲低Smpd3减轻了细胞凋亡和内质网应激。

l. 模型图总结：METTL3通过m6A依赖的RNA降解调控Smpd3表达，从而精细调节鞘脂代谢稳态，维持出生后肝脏的正常发育。

研究结论

1.METTL3的动态表达： RNA甲基转移酶Mettl3和Mettl14在雄性小鼠出生后肝脏发育过程中的表达逐渐下降，这与肝脏功能成熟的转录组重编程相吻合。

2.关键发育窗口期： 胚胎期起始的肝脏特异性Mettl3敲除导致生长迟缓和严重肝损伤(肝细胞肥大、凋亡、炎症)，而出生后1周起始的敲除则无明显表型，表明出生后3-4周内是Mettl3/m6A调控肝脏发育的关键窗口期。

3.核心分子机制： 机制上，METTL3通过m6A修饰促进Smpd3 mRNA的降解。Mettl3缺失导致Smpd3 mRNA稳定性增加、表达上调。

4.下游代谢紊乱： Smpd3的过表达导致其催化的产物——神经酰胺(特别是C16:0和C18:0/24:1)在肝脏中异常积累。

5.细胞器损伤： 神经酰胺的积累进而诱导线粒体损伤(嵴断裂、膜电位下降)和持久的内质网应激(PERK-eIF2α-ATF3通路激活)。

6.通路验证与挽救： 通过药理学抑制Smpd3(GW4869)、体内敲低Smpd3或过表达其拮抗酶Sgms1，均可部分或显著改善Mettl3缺陷引起的神经酰胺积累、细胞器损伤和整体肝脏病变。

7.结论与意义： 本研究首次揭示了METTL3-m6A-Smpd3轴在调控出生后肝脏鞘脂代谢稳态中的关键作用。METTL3/m6A作为一个“刹车”，通过及时清除Smpd3转录本，防止神经酰胺过度积累，从而保护肝细胞免受代谢损伤，确保肝脏的正常发育和功能成熟。这为理解表观转录组如何协调器官生长与功能成熟提供了新见解。

文献意义:

本研究首次揭示了RNA m6A修饰在调控出生后肝脏发育和代谢成熟中的关键作用。其核心创新点在于：

1.发现了时间窗口依赖性： 明确了METTL3/m6A在出生后早期(3-4周内)对肝脏正常发育至关重要，这解释了此前研究中关于Mettl3敲除表型矛盾的成因，强调了发育阶段的重要性。

2.连接了表观转录组与脂质代谢： 将METTL3介导的m6A修饰直接与鞘脂代谢的核心酶Smpd3以及有毒脂质中间体神经酰胺的稳态调控联系起来，开辟了代谢调控的新层面。

3.提供了潜在干预靶点： 证明了通过抑制Smpd3或调控其上下游通路，可以挽救由Mettl3缺失引起的代谢紊乱和肝损伤，提示Smpd3/神经酰胺通路可能成为治疗相关代谢性疾病或肝损伤的潜在靶点。