核酸研究新工具：HAMMER 精准检测 APOBEC3A mRNA 编辑活性

荧光素酶报告基因系统是一种基于荧光素酶催化底物氧化反应产生生物发光的检测技术，广泛应用于细胞生物学研究。其中，萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高灵敏度、宽线性检测范围(约7~8个数量级)以及较短的半衰期(在哺乳动物细胞中约为3小时，在植物细胞中约为3.5小时)而成为最常用的报告基因。其发光信号强度在酶浓度为10⁻¹⁶ mol/L至10⁻⁸ mol/L的范围内与酶活性呈线性关系，并且在理想条件下可检测到低至10⁻²⁰ mol/L的荧光素酶活性。此外，荧光素酶报告基因系统具有非放射性、检测快速、灵敏度高(比氯霉素乙酰转移酶CAT高100倍)等优点，特别适用于高通量筛选和活细胞检测。通过将荧光素酶报告基因载体转染至宿主细胞后，可利用荧光素酶检测系统灵敏且便捷地监测基因表达水平，已成为细胞生物学研究中的重要工具。

基本信息

英文标题：HAMMER: hairpin-based APOBEC3A-mediated mRNA editing reporter

中文标题：HAMMER：基于发夹结构的 APOBEC3A 介导的 mRNA 编辑报告系统

发表期刊：《Nucleic Acids Research》

影响因子：13.1

作者单位：

1.Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas San Antonio, San Antonio, TX 78229, United States

2.Howard Hughes Medical Institute, University of Texas San Antonio, San Antonio, TX 78229, United States

作者信息：

第一作者：Yanjun Chen

通讯作者：Reuben S. Harris

研究背景

人源 APOBEC3 家族酶是抵御内源性及外源性病毒复制的先天免疫屏障，其中 APOBEC3A(A3A)是人体活性最强的单链 DNA 脱氨酶，同时也能催化 RNA 的胞嘧啶 - 尿嘧啶(C-to-U)脱氨编辑，但其 RNA 编辑功能在病毒进化与癌症发生发展中的作用尚未明确，且目前缺乏快速、特异、可定量的细胞水平 A3A RNA 编辑检测方法，现有检测手段存在操作复杂、信号易受干扰、无法适配高通量抑制剂筛选等缺陷，严重制约了 A3A RNA 编辑的功能研究与靶向药物开发。

研究方法

研究人员基于 DDOST 基因的天然发夹序列改造构建了双荧光素酶报告质粒 HAMMER，将海肾荧光素酶、优化的 A3A 发夹底物与萤火虫荧光素酶串联表达，在 293T 细胞中开展共转染实验，通过双荧光素酶检测系统测定萤火虫 / 海肾荧光素酶活性比值以反映 A3A 编辑活性;同时构建催化失活突变体、线性序列对照、组成型终止密码子对照等载体验证系统有效性，结合 Sanger 测序分别检测报告系统的 RNA 与 DNA 编辑水平，利用免疫印迹实验验证蛋白表达;此外构建人源 APOBEC 家族全套蛋白、灵长类 A3A 同源蛋白及疱疹病毒核糖核苷酸还原酶(RNR)表达载体，验证 HAMMER 的特异性并筛选 A3A 抑制剂，同步采用 AMBER DNA 编辑报告系统进行平行验证，辅以系统发育分析解析病毒 RNR 的抑制特性。

实验结果

图 1 HAMMER 报告系统的设计与功能验证

该研究设计了包含 DDOST 衍生发夹的 Hairpin1 核心报告质粒、含组成型终止密码子的 Stop1 对照质粒及无发夹结构的 Linear1 对照质粒，转染 293T 细胞后发现 Hairpin1 可正常表达海肾和萤火虫双荧光素酶，Stop1 仅表达海肾荧光素酶，证明终止密码子可完全阻断下游萤火虫荧光素酶翻译;共转染野生型 A3A 后，Hairpin1 的萤火虫 / 海肾荧光素酶比值显著降低 80%，而催化失活突变体 A3A-E72A 无明显作用，Linear1 报告系统则不受 A3A 影响，证实 HAMMER 的信号输出严格依赖 A3A 的催化活性与发夹结构底物，且 DDOST 衍生发夹是最优的 A3A RNA 编辑底物序列。

图 2 HAMMER 剂量依赖性特异性检测 A3A 的 RNA 编辑活性

实验结果显示 HAMMER 的荧光信号随 A3A 表达量升高呈剂量依赖性降低，A3A-E72A 突变体无论表达量高低均无此效应，且蛋白免疫印迹证实野生型与突变体 A3A 表达水平一致;Sanger 测序结果明确 A3A 仅编辑 HAMMER 报告系统的 mRNA，对报告质粒 DNA 无脱氨作用，且荧光素酶比值与 RNA C-to-U 编辑频率呈显著负相关;同时通过 AMBER DNA 编辑报告系统平行验证，区分了 A3A 的 DNA 与 RNA 编辑活性，证明 HAMMER 可精准、定量检测细胞内 A3A 的 RNA 编辑活性，无 DNA 脱氨干扰。

图 3 HAMMER 高度特异性识别人源 A3A 的 RNA 编辑活性

研究对 9 种有催化活性的人源 APOBEC 家族脱氨酶进行检测，仅人源 A3A 可触发 HAMMER 产生显著信号，高度同源的 A3B 催化域、A3B、A3C、A3D、A3F、A3G、A3H 等家族成员均无 RNA 编辑活性，AID 及结合辅因子的 APOBEC1 也无法激活 HAMMER;灵长类 A3A 同源蛋白检测中，人源 A3A 活性最强，恒河猴 A3A 仅表现出微弱活性，狨猴 A3A 无活性，充分证明 HAMMER 对人源 A3A 具有极高特异性，可精准区分同源蛋白的功能差异。

图 4 HAMMER 成功筛选出抑制 A3A 活性的疱疹病毒 RNR 蛋白

研究先对多种疱疹病毒核糖核苷酸还原酶(RNR)大亚基进行系统发育分析，再通过 HAMMER 检测发现 EBV 的 BORF2 可剂量依赖性恢复荧光素酶比值，即强效抑制 A3A 的 RNA 编辑活性，AMBER 系统同步证实其可抑制 A3A 的 DNA 编辑活性;进一步筛选发现 HSV-1、KSHV 的 RNR 具有中等抑制作用，旧大陆灵长类疱疹病毒的 RNR 均可强效抑制人源 A3A，新大陆灵长类疱疹病毒的 RNR 则无抑制效果，证明 HAMMER 可作为高效工具用于 A3A 抑制剂的筛选与功能表征。

研究结论

本研究成功开发了名为 HAMMER 的双荧光素酶报告系统，该系统以 DDOST 衍生发夹为核心底物，可快速、定量、高特异性地检测细胞内人源 APOBEC3A 的 mRNA 编辑活性，其信号输出仅响应 A3A 的催化活性且严格依赖发夹结构，不受 DNA 脱氨作用及其他 APOBEC 家族蛋白干扰;研究利用 HAMMER 系统筛选并验证了多种疱疹病毒核糖核苷酸还原酶对 A3A 的抑制作用，明确了旧大陆灵长类疱疹病毒 RNR 的强效抑制特性，不仅为 A3A 的 RNA 编辑功能研究、病毒拮抗 A3A 的分子机制解析提供了核心工具，也为靶向 A3A 的抗癌药物、抗病毒药物高通量筛选奠定了技术基础。