破解乙肝入侵机制：NTCP K340 位点泛素化至关重要

乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共卫生问题之一，有超过2.5亿人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我国，人数接近1亿人。NTCP工具细胞，特别是外源表达NTCP的肝癌细胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重现性佳的特点，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演着至关重要的角色。这些细胞模型能够有效模拟HBV的感染过程，为研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒复制以及药物筛选提供了一个强大而便捷的体外平台。它们不仅有助于揭示HBV感染的分子机制，如DDX3作为宿主限制因子阻碍cccDNA转录，GPC5作为附着因子在感染入胞过程中的作用，还能通过直接与NTCP相互作用或下调NTCP表达来筛选和验证抗病毒药物的活性，例如环孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，这些工具细胞还促进了对HBV宿主特异性分子的发现，为发展支持HBV感染的小动物模型提供了可能，这对于乙肝相关研究和药物开发具有重大意义。

基本信息

英文标题：NTCP ubiquitination enables HBV infection

中文标题：NTCP 泛素化介导乙型肝炎病毒感染

发表期刊：《JHEP Reports》

影响因子：7.5

作者单位：

1.Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Amsterdam University Medical Centers, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands

2.Amsterdam Gastroenterology, Endocrinology and Metabolism (AGEM), Amsterdam University Medical Centers, The Netherlands

3.Institute of Virology, Technical University of Munich/Helmholtz Munich, Munich, Germany

4.German Center for Infection Research (DZIF), Munich Partner Site, Munich, Germany

作者信息：

第一作者：Monique D. Appelman, Thuc-Anh Nguyen(共同第一作者)

通讯作者：Stan F.J. van de Graaf

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)/ 丁型肝炎病毒(HDV)感染是全球重大肝病致死病因，钠离子 - 牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)是 HBV/HDV 入侵肝细胞的关键受体，但 NTCP 介导病毒内化的具体机制尚未明确;泛素化是调控膜蛋白内吞、降解的重要翻译后修饰，虽已知泛素化参与 NTCP 的降解过程，但其在生理水平下对 NTCP 内吞及 HBV 入侵的调控作用仍未知，本研究旨在探究 NTCP 泛素化修饰对其内吞功能及 HBV 感染的影响。

研究方法

研究构建 NTCP 野生型(NTCP^WT)及 K340R 等位点突变的稳转细胞系(HepG2、U2OS、HepaRG)，通过免疫共沉淀检测 NTCP 泛素化水平，利用生物素脉冲示踪法测定 NTCP 内吞效率，采用 [³H] 牛磺胆酸盐孵育检测胆汁酸摄取能力，通过 Myrcludex B-FITC 标记、HBV 感染实验(检测 HBsAg、cccDNA、总 HBV DNA 等)评估病毒结合与感染效率，并用泛素激活酶抑制剂 TAK-243 干预细胞验证泛素化的作用，实验数据采用 Mann-Whitney U 检验、单因素 ANOVA 等方法进行统计学分析。

实验结果

图 1：NTCP 可发生泛素化修饰

在稳定表达 HA 标签 NTCP 的 U2OS 细胞中，外源转染的 FLAG - 泛素可与 HA-NTCP 发生共沉淀，内源性泛素也能与 NTCP 特异性结合，且 NTCP 呈现出单泛素化与多泛素化两种修饰条带，直接证实 NTCP 是可被泛素化修饰的肝细胞膜蛋白。

图 2：K340 是 NTCP 核心泛素化位点，其突变提升 NTCP 膜丰度与转运活性

NTCP C 端 6 个赖氨酸位点中，仅 K340 位点突变(K340R)及包含 K340 的六位点联合突变，可显著提升 NTCP 蛋白表达量与细胞膜丰度，牛磺胆酸盐摄取活性较野生型提升约 3 倍;泛素化抑制剂 TAK-243 处理可模拟该表型，免疫沉淀结果显示 K340R 突变体泛素化水平显著降低，且该突变不影响 NTCP 的 N - 糖基化修饰，明确 K340 是 NTCP 的主要泛素化靶点。

图 3：K340R 突变显著抑制 NTCP 的内吞过程

采用生物素脉冲示踪法检测 NTCP 内吞效率，4℃标记细胞膜 NTCP 后 37℃孵育启动内吞，结果显示 NTCP^K340R 突变体的内吞比例较野生型 NTCP 大幅下降，证实 K340 位点的泛素化是调控 NTCP 内吞的关键氨基酸位点。

图 4：NTCP^K340R 突变体大幅降低 HBV 感染效率

尽管 NTCP^K340R 细胞膜丰度升高使 Myrcludex B-FITC 结合信号增强(HBV 结合能力提升)，但 HepG2 细胞感染 HBV 后，HBsAg、cccDNA、总 HBV DNA 等感染标志物水平较野生型组降低约 80%，Myrcludex B 与肝素可完全抑制感染，说明 K340 介导的泛素化内吞是 HBV 高效感染肝细胞的必需环节。

图 5：泛素化抑制剂 TAK-243 可显著抑制 HBV 感染

用 TAK-243 处理过表达野生型 NTCP 的 HepG2 与 HepaRG 细胞后，细胞整体泛素化水平降低，HBV 感染的荧光素酶活性、总 HBV DNA、cccDNA 水平均呈浓度依赖性下降，从药理学角度证实抑制 NTCP 泛素化可有效阻断 HBV 入侵肝细胞。

研究结论

本研究证实 NTCP 的 K340 位点是其核心泛素化修饰位点，该位点泛素化介导 NTCP 的网格蛋白依赖型内吞，K340R 突变虽能提升 NTCP 细胞膜丰度与胆汁酸转运能力，但会显著抑制 NTCP 内吞并降低 HBV 感染效率，泛素化抑制剂 TAK-243 可模拟该突变效应，明确 NTCP 泛素化依赖的内吞是 HBV 入侵肝细胞的关键机制，为抗 HBV 感染提供了全新的药物靶点与干预策略。