表木兰脂素 A 通过抑制 p38/NF-κB 及 AP-1 信号通路减少 PMA 诱导的 THP-1 细胞 IL-6 生成

Reporter THP1 Cell Line 细胞系是以 THP-1 为工具细胞，采用慢病毒感染的方式，构建稳定表达报告基因的细胞系，可用于检测信号通路转导。在被PMA、INF-α等刺激后，目标信号通路被激活，会启动下游特定基因的表达，这个表达过程会同时带动“报告基因”的表达。通过检测报告基因的信号强度，可以间接、定量、灵敏地衡量该信号通路的激活程度。

THP-1细胞本身来源于人单核细胞，可以分化为巨噬细胞样细胞，是研究先天免疫的经典模型。报告基因株的建立使其功能更强大。THP-1报告基因株是免疫学、炎症性疾病、药物研发等领域不可或缺的强大工具。它可以将一个复杂的、内在的生物学过程(信号通路激活/基因表达)转变为一个易于检测、可定量的物理信号(光或荧光)。这使得研究人员能够高通量地筛选药物，精确地量化免疫反应强度，直观地研究信号通路机制。

基本信息

英文标题：Epimagnolin A inhibits IL‐6 production by inhibiting p38/NF‐κB and AP‐1 signaling pathways in PMA‐stimulated THP‐1 cells

中文标题：表木兰脂素 A 通过抑制 p38/NF-κB 及 AP-1 信号通路减少 PMA 诱导的 THP-1 细胞 IL-6 生成

发表期刊：《Environmental Toxicology》

影响因子：3.2

作者单位：

1.Department of Bioscience and Biotechnology, Konkuk University, Seoul, Republic of Korea

2.Department of Stem cell and Regenerative Biotechnology, Konkuk University, Seoul, Republic of Korea

3.Natural Medicine Research Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Cheongju-si, Chungcheongbukdo, Republic of Korea

4.College of Pharmacy and Medical Research Center, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk, Republic of Korea

作者信息：

第一作者(First author)：Hyun-Woo Chun

通讯作者(Corresponding author)：Do-Young Yoon

研究背景

炎症是机体应对微生物入侵与组织损伤的重要防御反应，而过度炎症会驱动类风湿关节炎、克罗恩病、阿尔茨海默病等多种炎症相关疾病的发生发展，在此过程中巨噬细胞等免疫细胞会大量释放 TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子，进一步放大炎症级联反应并造成机体损伤，因此通过下调炎症介质来控制炎症反应具有重要的研究与临床价值。THP-1 细胞是常用于单核 / 巨噬细胞免疫炎症研究的经典细胞模型，PMA 可通过激活 PKC 家族启动下游信号传导，进而激活 MAPKs 通路并调控 NF-κB、AP-1 等关键转录因子，最终促进 IL-6 等炎症因子的大量表达。辛夷为传统药用植物，其提取物常用于鼻窦炎、过敏性鼻炎等炎症相关病症，已有研究从辛夷中分离得到的表木兰脂素 A 在 A549 细胞及 RAW264.7 细胞中可抑制一氧化氮生成，且同属植物来源的 fargesin 已被证实具有抗炎活性，但表木兰脂素 A 在 PMA 诱导的 THP-1 细胞中发挥抗炎作用的具体分子机制尚未被清晰阐明，因此本研究旨在系统探究表木兰脂素 A 对 IL-6 生成的影响及背后的 p38/NF-κB/AP-1 信号调控机制。

研究方法

本研究以人单核细胞 THP-1 为实验模型，采用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基在 37℃、5% CO₂条件下进行培养，控制传代次数不超过 20 代以保证细胞状态稳定;从辛夷花蕾中经甲醇提取、溶剂萃取、硅胶柱层析及反相 HPLC 分离纯化获得表木兰脂素 A;通过 MTS 法检测 1–20 μM 表木兰脂素 A 对 THP-1 细胞活力的影响，确定无细胞毒性的安全作用浓度;采用 RT-qPCR 与普通 RT-PCR 检测 IL-6 的 mRNA 表达水平，以 GAPDH 作为内参基因;利用 ELISA 试剂盒测定细胞上清中分泌型 IL-6 的蛋白含量;通过蛋白免疫印迹技术检测 MAPKs 通路中 p38、ERK、JNK 的磷酸化水平，以及细胞核与细胞质中 NF-κB 亚基 p50/p65、AP-1 亚基 c-Jun/c-Fos、STAT3、C/EBPβ 的蛋白表达;构建 IL-6 启动子荧光素酶报告质粒，采用脂质体转染法并通过双荧光素酶报告基因系统检测 IL-6 启动子活性;运用核浆分离试剂盒分别提取胞浆与核蛋白，以 PARP 作为核内参照、GAPDH 作为胞浆参照;采用染色质免疫沉淀技术(ChIP)检测 NF-κB 亚基 p50 与 AP-1 亚基 c-Jun 在 IL-6 启动子区域的结合水平;所有实验均设置至少三次生物学重复，数据以均值 ± 标准差表示，采用单因素方差分析结合 Tukey HSD 检验进行统计学分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。

实验结果

图 1 表木兰脂素 A 对 PMA 刺激的 THP-1 细胞活力的影响

本实验通过 MTS 法评估不同浓度表木兰脂素 A 对细胞活力的作用，结果显示在 1–20 μM 浓度范围内，无论是否联合 PMA 刺激，表木兰脂素 A 处理 THP-1 细胞 24 小时后均未出现明显的细胞毒性，细胞存活率与对照组相比无显著下降，这一结果为后续抗炎机制研究确定了安全的药物浓度范围，确保实验中观察到的 IL-6 下调效应并非由细胞死亡或损伤所导致，为整个研究的可靠性提供了重要前提保障。

图 2 表木兰脂素 A 对 PMA 诱导 THP-1 细胞 IL-6 mRNA 及蛋白水平的抑制作用

为明确表木兰脂素 A 是否能够抑制炎症关键因子 IL-6 的表达，研究分别从转录和翻译水平进行检测，RT-qPCR 结果表明表木兰脂素 A 以浓度依赖的方式显著降低 PMA 诱导的 IL-6 mRNA 水平，同时 ELISA 结果显示细胞上清中分泌的 IL-6 蛋白也被明显抑制，且抑制效果与阳性对照 fargesin 相近，上述结果直接证实表木兰脂素 A 能够在 mRNA 和蛋白两个层面阻断 PMA 诱导的 IL-6 高表达，展现出明确的体外抗炎活性。

图 3 表木兰脂素 A 对 PMA 诱导 MAPKs 磷酸化的影响及 p38 通路介导作用

为定位表木兰脂素 A 发挥作用的上游信号节点，研究检测了经典 MAPKs 家族蛋白的磷酸化水平，结果显示表木兰脂素 A 能够显著抑制 PMA 诱导的 p38 磷酸化，且呈现时间与浓度依赖性，而对 ERK1/2 和 JNK 的磷酸化无明显影响;进一步使用 p38 特异性抑制剂 SB203580 进行验证，发现抑制剂与表木兰脂素 A 联用可进一步降低 IL-6 的 mRNA 与蛋白水平，充分证明 p38 MAPK 通路是表木兰脂素 A 抑制 IL-6 生成的关键上游信号通路。

图 4 表木兰脂素 A 对转录因子核转位的影响

NF-κB 与 AP-1 是调控 IL-6 转录的核心转录因子，其从胞浆向胞核的转位是激活下游炎症基因表达的关键步骤，核浆分离实验结果显示，PMA 刺激可显著促进 p50(NF-κB)和 c-Jun(AP-1)向细胞核内转移，而表木兰脂素 A 预处理能够明显阻断这一核转位过程，对 p65、c-Fos、STAT3、C/EBPβ 等其他转录因子则无显著影响，说明表木兰脂素 A 可选择性抑制 NF-κB 与 AP-1 的激活与核转位，进而从转录起始环节抑制 IL-6 表达。

图 5 表木兰脂素 A 对 IL-6 启动子结合活性及启动子活性的影响

为进一步确认表木兰脂素 A 在转录水平的调控机制，研究采用 ChIP 与荧光素酶报告基因实验进行验证，ChIP 结果显示表木兰脂素 A 能显著减弱 p50 和 c-Jun 与 IL-6 启动子上相应结合位点的结合能力，荧光素酶实验则直接证明表木兰脂素 A 可浓度依赖性抑制 PMA 诱导的 IL-6 启动子活性，上述结果从 DNA - 蛋白相互作用与启动子功能层面完整证实，表木兰脂素 A 通过降低 NF-κB 和 AP-1 与 IL-6 启动子的结合效率来抑制 IL-6 的转录激活。

研究结论

本研究系统证实源自辛夷的表木兰脂素 A 在 PMA 刺激的 THP-1 细胞中具有显著抗炎活性，其作用机制为选择性抑制 p38 MAPK 的磷酸化，进而阻断下游 NF-κB 亚基 p50 与 AP-1 亚基 c-Jun 的核转位，并降低这两种转录因子与 IL-6 启动子的结合能力，最终在 mRNA 和蛋白水平显著抑制促炎因子 IL-6 的生成，且在有效抗炎浓度范围内无明显细胞毒性，表明表木兰脂素 A 可作为靶向 p38/NF-κB/AP-1 通路的潜在抗炎先导化合物，为炎症相关疾病的天然药物研发提供了新的实验依据与分子靶点。